Denne metode kan bidrage til at besvare centrale spørgsmål i den menneskelige pluripotente stamcellebiologi område om funktionalitet og inflammatoriske reaktioner af humane induceret pluripotente stamceller-afledte endotelceller. Den største fordel ved denne teknik er, at den giver en detaljeret beskrivelse af den eksperimentelle opsætning og dataanalyse til vurdering af leukocyt vedhæftning til human induceret pluripotente stamcellebaserede endotelceller. Til mikrofluidisk spånbelægning skal der anvendes en steril biochip i en 10 centimeter steril petriskål, og der anvendes en 10-mikroliterpipettespids til at injicere 10 mikroliter frisklavet fibronectinarbejdsopløsning i hver kanal i biochippen.
Dæk petriskålen og læg den i et befugtet kammer natten over ved fire grader Celsius. Den næste morgen, pre-varm biochip i en 37-graders Celsius inkubator, og re-suspendere menneskelige induceret pluripotente stamceller-afledte endotelceller høstet fra en 80 til 100% sammenløbet cellekultur ved den ønskede koncentration i en frisk endotel celle serum-fri medium. Dernæst aspirere fibronectinopløsningen fra alle kanalerne i den mikrofluidiske chip, og bland cellerne grundigt for at opnå en homogen cellesuspension, før du bruger en 10-mikroliterpipettespids til at injicere seks mikroliter celler i hver kanal.
Undersøg biochippen under mikroskopet for at bekræfte, at cellerne er jævnt fordelt med en høj celletæthed. Efter 15 minutter ved 37 grader Celsius, tilsæt 40 mikroliter endotel celle serum-fri medium FULD i medium reservoirer på begge sider af hver kanal. Og returnere biochip til kuvøsen i en time.
Derefter tilsættes yderligere 50 mikroliter af endotelcelleserumserumfrit medium FULL i reservoirerne på begge sider af hver kanal. For levende billeddannelse af de seedede celler skal du bekræfte, at mikrofluidiske opsætninger er klar, at det levende billeddannelseskammer er ækvilibreret til 37 grader Celsius, og at CO2-niveauet har nået 5%Placer biochippen i mikroskopchipholderen og monterer chipholderen på mikroskopbilleddannelsesfasen. For at forbinde biochippen til pumpen via manifolden skal du placere den otte-benet adapter tæt på chippens udløbsreservoirer og uddybe alle stifterne i mediet uden at forbinde stifterne helt.
I mikrofluidic pumpe software, skal du vælge Washout / Connect til chip, og klik Kør Assay Step at dispensere 30 mikroliter af RPMI medium gennem hver pin. Sæt derefter den otte-pin adapter i stikkontakten af biochippen. Brug en pipette til manuelt at aspirere mediet fra alle indløbsreservoirerne i biochippen, og vælg Washout/Chip Washout og Run Assay Step for at gennemvæde en kanal ad gangen med 40 mikroliter endotelcelleserumsumfrit medium Full for at fjerne eventuelle døde celler og snavs.
Når alle kanalerne er blevet vasket erstatte medium fra indløb reservoir af kanalen af interesse med 100 mikroliter af menneskelige leukocytter fortyndet til en 2,5 gange 10 til de seks celler pr milliliter koncentration i RPMI medium. Klik på Beskrivelse af celleanalyse/trin, og angiv beskrivelsen af aktuel kanal/trin, og angiv den kanal, der er interesseret i Til, og de andre syv kanaler til Fra. Vælg beskrivelse af celleanalysetrin, og klik på Kør analysetrin.
De resterende leukocytter i indløbsbeholderen er blevet udskiftet med 100 mikroliter af komplet RPMI-medium. Og klik cell assay trin beskrivelse og Kør Assay Step at gennemgå kanalen i fem minutter med RPMI medium for at fjerne eventuelle nonadherent leukocytter. Derefter erhverve billeder fra mindst tre til fire forskellige positioner i kanalen for at visualisere de klæbede leukocytter.
Hvis du vil kvantificere de klæbende leukocytter, skal du åbne CellProfiler-billedbehandlingssoftwaren og importere count Leukocytes Pipeline-filen. Vælg Billeder under Inputmoduler, og træk og slip mappen med de rå billeder af de klæbende leukocytter til vinduet Filliste. Under Analysemoduler skal du vælge Identificer primære objekter og angive de minimale og maksimale diametre for de klæbende leukocytter i pixel.
Vælg FilterObjekter under Analysemoduler. Vælg derefter filtreringskriterierne, og angiv objekternes minimalt accepterede område i pixel, og klik på Analysér billeder for at starte analysen. Optimal human induceret pluripotent stamcelle-afledt endotelcelle dissociation bør resultere i en enkelt celle suspension fri for celle klumper.
Typisk, 15 minutter efter injektion endotelceller vil knytte til bunden af kanalen og begynder at sprede sig. Inden for en time efter injektionen skal endotelcellerne danne et velspredningsmonolayer over kanalen, hvorefter de er klar til brug i Flow-analysen. Ved hjælp af den gratis open source billedbehandling software som påvist tillader filtrering af identificerede objekter baseret på et minimalt område, og udelukkelse af falsk identificerede objekter såsom celle snavs, autofluorescens, eller enhver anden uspecifik fluorescerende signal.
Mens du forsøger denne procedure, Er det vigtigt at huske at optimere stimulation med pro-inflammatoriske cytokiner og til at omfatte primære menneskelige navlestrengsceller endotelceller som en positiv kontrol. Glem ikke, at arbejde med primære pattedyr celle og celle linjer kan være yderst farligt, og at forholdsregler såsom iført laboratoriekittel, handsker og øjenbeskyttelse bør altid tages, mens du udfører denne procedure.