Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de menselijke pluripotente stamcelbiologie veld over de functionaliteit en ontstekingsreacties van de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide endotheelcellen te beantwoorden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een gedetailleerde beschrijving geeft van de experimentele opzet en data-analyse voor de beoordeling van leukocytenhechting op door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide endotheelcellen. Voor microfluïde chipcoating plaatst u een steriele biochip in een steriele petrischaal van 10 centimeter en gebruikt u een pipettip van 10 microliter om 10 microliter vers bereide fibronectine-werkoplossing in elk kanaal van de biochip te injecteren.
Bedek de petrischaal en plaats deze 's nachts in een bevochtigde kamer bij vier graden Celsius. De volgende ochtend, pre-warm de biochip in een 37-graden Celsius incubator, en re-suspend menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide endotheelcellen geoogst van een 80 tot 100% confluent celkweek bij de gewenste concentratie in een verse endotheelcel serum-vrij medium. Vervolgens, aspirate de fibronectin oplossing uit alle kanalen van de microfluïde chip, en grondig mengen van de cellen om een homogene cel suspensie te verkrijgen voordat u een 10-microliter pipet tip om zes microliter cellen injecteren in elk kanaal.
Bestudeer de biochip onder de microscoop om te bevestigen dat de cellen gelijkmatig zijn verdeeld met een hoge celdichtheid. Voeg na 15 minuten bij 37 graden Celsius 40 microliters endotheelcelserumvrij medium FULL toe aan de medium reservoirs aan beide zijden van elk kanaal. En breng de biochip een uur terug naar de couveuse.
Voeg vervolgens nog eens 50 microliters van endotheelcel serum-vrij medium FULL in de reservoirs aan beide zijden van elk kanaal. Voor live beeldvorming van de gezaaide cellen, bevestigen dat de microfluïde opstellingen klaar zijn, dat de live imaging kamer is geëquilibreerd tot 37 graden Celsius, en dat het CO2-niveau heeft bereikt 5%Plaats de biochip in de microchip houder en monteer de chip houder op de microscoop beeldvorming stadium. Om de biochip via het spruitstuk op de pomp aan te sluiten, plaatst u de acht-pins adapter dicht bij de uitlaatreservoirs van de chip en verdiept u alle pinnen in het medium zonder de pinnen volledig aan te sluiten.
Selecteer in de microfluïde pompsoftware Washout/Connect to chip en klik op Run Assay Step om 30 microliter RPMI-medium via elke pin af te geven. Steek vervolgens de acht-pin adapter in het stopcontact van de biochip. Gebruik een pipet om het medium handmatig aan te trekken uit alle inlaatreservoirs van de biochip, en selecteer Washout/Chip Washout en Run Assay Step om één kanaal tegelijk te befuven met 40 microliters van endothelial cell serumvrij medium Full om dode cellen en puin te verwijderen.
Wanneer alle kanalen zijn gewassen, vervang het medium uit het inlaatreservoir van het kanaal van belang door 100 microliter menselijke leukocyten verdund tot een 2,5 keer 10 tot de zes cellen per milliliterconcentratie in RPMI-medium. Klik op Celtest/Stapbeschrijving en Stel de beschrijving Huidige kanaal/stap in en stel het interessekanaal in op Aan en de andere zeven kanalen op Uit. Selecteer de beschrijving van de stap van celtest en klik op Stap testen uitvoeren.
Vervang de resterende leukocyten in het inlaatreservoir door 100 microliter van volledig RPMI-medium. En klik op Cell Assay Step beschrijving en Run Assay Step om het kanaal vijf minuten door te nemen met RPMI-medium om niet-adherent leukocyten te verwijderen. Verwerf vervolgens beelden van ten minste drie tot vier verschillende posities in het kanaal om de aangehangen leukocyten te visualiseren.
Als u de aanhangende leukocyten wilt kwantificeren, opent u de CellProfiler-beeldverwerkingssoftware en importeert u het bestand Count Leukocytes Pipeline. Selecteer onder Invoermodules Afbeeldingen en sleep-en-drop de map met de ruwe afbeeldingen van de aanhanger leukocyten naar het venster Bestandslijst. Selecteer onder Analysemodules primaire objecten identificeren en geef de minimale en maximale diameters van de aanhangende leukocyten in pixels aan.
Selecteer onder Analysemodules FilterObjects. Selecteer vervolgens de filtercriteria en voer het minimaal geaccepteerde gebied van de objecten in pixels in en klik op Afbeeldingen analyseren om de analyse te beginnen. Optimale door de mens veroorzaakte pluripotente stamcel-afgeleide endotheelceldissociatie moet resulteren in een enkele cel suspensie vrij van celklontjes.
Typisch, 15 minuten na injectie de endotheelcellen zal hechten aan de onderkant van het kanaal en beginnen te verspreiden. Binnen een uur na de injectie moeten de endotheelcellen een goed gespreide monolaag over het kanaal vormen op welk punt ze klaar zijn voor gebruik in de Flow-test. Met behulp van de gratis open-source beeldverwerkingssoftware zoals aangetoond, kunnen geïdentificeerde objecten worden gefilterd op basis van een minimaal gebied en de uitsluiting van verkeerd geïdentificeerde objecten zoals celpuin, autofluorescentie of enig ander niet-specifiek fluorescerend signaal.
Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de stimulatie te optimaliseren met pro-inflammatoire cytokines en om primaire menselijke navelstrengader endotheliale cellen op te nemen als een positieve controle. Vergeet niet dat het werken met primaire zoogdiercel- en cellijnen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van laboratoriumjas, handschoenen en oogbescherming altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.