Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i Klebsiella-feltet, såsom hvilke gener der bruges til at regulere kapsel og tilhørende virulents. De største fordele ved denne teknik er, at det giver et middel til fysisk separate kapsulerede og ikke-capsulated stammer, og det kan også bruges til hurtige sammenligninger mellem stammer af kapselproduktion. Selv om denne metode blev udviklet til at studere kapsel regulering i Klebsiella, det kan også anvendes på forskellige bakteriearter.
Generelt personer, der er nye til denne metode vil kæmpe, fordi hælde gradienter og tilføje cellerne til gradienter kan være ganske vanskeligt. Visuel demonstration af denne metode er kritisk, da vi viser de teknikker, der er vanskelige at mestre, giver forslag og tips til at hjælpe brugeren. Til at begynde, skal du vælge en enkelt koloni fra en lagerplade med en steril løkke, og inokulere 10 milliliter af en passende bouillon.
Inkuber kulturen natten over. Overfør derefter kulturen til et 15 milliliterrør og centrifuge. Dernæst kasseres supernatanten, og pellet i to milliliter PBS igen.
Gentag centrifugering, og kassér den resulterende supernatant. Derefter re-suspendere pellet i to milliliter PBS. Hvis du vil oprette fortyndingsgraden for tætning, skal du kombinere tæthedsgradientmed PBS.
Derefter aliquot 600 mikroliter af hver gradient fortynding i de enkelte to milliliter rør. Tag op 100 mikroliter af celler med en 200 mikroliter pipette, og placere pipette spidsen på siden af røret lige under menisken af en af de mange gradienter. Aspirere bakteriecellerne på gradienten meget langsomt, og pas på ikke at blande grænsefladen.
Centrifuge de forberedte rør i 10 minutter ved 8,000 g's. Derefter overføres rørene til et rack for at visualisere den mindste gradientfortynding, der kræves for at bevare cellerne lige over gradientlaget. Først overføres en milliliter af den mest fortyndede gradientgradion i et fem milliliter rundbundet rør.
Brug en sprøjte med en 1,5 tommer nål, tage op en milliliter af den næste mest koncentrerede tæthed gradient. Anvend nålen i bunden af røret og injicer indholdet af sprøjten meget langsomt. Der skal være en klar grænseflade på hvert trin i tætheden gradient.
Hvis lagene blandes, vil du ikke opnå ren adskillelse af dine bakterier. Fjern nålen forsigtigt fra gradienten for ikke at forstyrre grænsefladen mellem gradientfortyndingerne. Læg derefter røret i et stativ.
Tilsæt forsigtigt 600 mikroliter af de forberedte celler til toppen af gradienten i røret. Derefter anbringes røret i en røradapter, og røret vejes med adapteren for at sikre balance. Derefter anbringes røradapteren i en fast vinkelrotor i en bænk-top-centrifuge, og røret centrifugeres i 30 minutter ved 3.000 g.
Endelig, efter centrifugering, fjerne røret forsigtigt, placere den i en rack, og fotografere resultaterne. I denne protokol blev massefylde centrifugering af massefylde brugt til at adskille bakteriestammer baseret på, hvor meget kapsel de producerer. Selv om de nøjagtige resultater afhænger af bakteriearter, vil de fleste stammer migrere til et enkelt sted inden for gradienten.
Anvendelse af denne metode på et bakterielt mutant bibliotek bør producere et større bånd over gradienten, et mindre tæt bånd gennem det øverste lag af gradienten og en mindre acapsular fraktion i bunden. Under forsøg på denne procedure er det vigtigt at huske, at gradientgrænsefladerne ikke må blandes, og gradienten må ikke indeholde luftbobler. Efter proceduren bør der udføres valideringsmetoder såsom uronsyreanalyse eller mikroskopi for at undersøge kapselmængderne.
Dette er især vigtigt, når du bruger denne teknik til nye stammer. Glem ikke, at arbejde med Hazard Group 2 patogener kan være farligt. Der bør altid træffes forholdsregler såsom korrigerende beskyttelsesudstyr, overholdelse af risikovurderinger og korrekt bortskaffelse af kulturer, når denne procedure udføres.
