Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de Klebsiella, telles que les gènes utilisés pour réguler la capsule et les virulents associés. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle fournit un moyen de séparer physiquement les souches capsulées et non capsulées, et elle peut également être utilisée pour des comparaisons rapides entre les souches de production de capsules. Bien que cette méthode ait été développée pour étudier la régulation des capsules à Klebsiella, elle peut également être appliquée à différentes espèces bactériennes.
Généralement, les individus qui sont nouveaux à cette méthode auront du mal parce que verser les gradients et l’ajout des cellules aux gradients peut être assez difficile. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car nous montrons les techniques qui sont difficiles à maîtriser, fournissant des suggestions et des conseils pour aider l’utilisateur. Pour commencer, choisissez une seule colonie à partir d’une plaque de stock avec une boucle stérile, et inoculez 10 millilitres d’un bouillon approprié.
Incubez la culture du jour au lendemain. Ensuite, transférez la culture dans un tube de 15 millilitres et une centrifugeuse. Ensuite, jetez le supernatant et suspendez la pastille en deux millilitres de PBS.
Répétez la centrifugation et jetez le supernatant qui en résulte. Puis suspendez la pastille en deux millilitres de PBS. Pour créer les dilutions de gradient de densité, combinez le milieu de gradient de densité avec le PBS.
Puis aliquot 600 microlitres de chaque dilution de gradient en tubes individuels de deux millilitres. Prenez 100 microlitres de cellules avec une pipette de 200 microlitres, et placez la pointe pipette sur le côté du tube juste en dessous du ménisque de l’un des nombreux gradients. Aspirez les cellules bactériennes sur le gradient très lentement, en prenant soin de ne pas mélanger l’interface.
Centrifugeuse les tubes préparés pendant 10 minutes à 8000 g. Après cela, transférez les tubes sur une grille pour visualiser la dilution minimale de gradient nécessaire pour retenir les cellules juste au-dessus de la couche de gradient. Tout d’abord, transférez un millilitre de la dilution de gradient de densité la plus diluée dans un tube à fond rond de cinq millilitres.
À l’aide d’une seringue avec une aiguille de 1,5 pouce, prendre un millilitre du gradient de densité le plus concentré suivant. Placez l’aiguille au fond du tube et injectez le contenu de la seringue très lentement. Il doit y avoir une interface claire à chaque étape du gradient de densité.
Si les couches se mélangent, vous n’atteindrez pas la séparation propre de vos bactéries. Retirez doucement l’aiguille du gradient afin de ne pas perturber l’interface entre les dilutions de gradient. Ensuite, placez le tube dans une grille.
Ajouter soigneusement 600 microlitres des cellules préparées au sommet du gradient dans le tube. Placez ensuite le tube dans un adaptateur de tube, et pesez le tube avec l’adaptateur pour assurer l’équilibre. Après cela, placez l’adaptateur de tube dans un rotor à angle fixe dans une centrifugeuse à dessus de banc, et centrifuger le tube pendant 30 minutes à 3000 g.
Enfin, après centrifugation, retirez soigneusement le tube, placez-le dans une grille et photographiez les résultats. Dans ce protocole, la centrifugation du gradient de densité a été utilisée pour séparer les souches bactériennes en fonction de la quantité de capsules qu’elles produisent. Bien que les résultats exacts dépendent de l’espèce bactérienne, la plupart des souches migreront vers un seul endroit dans le gradient.
L’application de cette méthode à une bibliothèque mutante bactérienne devrait produire une bande majeure au-dessus du gradient, une bande moins dense à travers la couche supérieure du gradient, et une fraction acapsulaire mineure au fond. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que les interfaces de gradient ne doivent pas être mélangées, et le gradient ne doit pas contenir des bulles d’air. Après la procédure, des méthodes de validation telles que l’analyse de l’acide uronique ou la microscopie devraient être effectuées pour examiner les quantités de capsules.
Ceci est particulièrement important lors de l’utilisation de cette technique pour de nouvelles souches. N’oubliez pas que travailler avec les agents pathogènes du groupe Hazard 2 peut être dangereux. Des précautions telles que l’équipement de protection corrective, le respect des évaluations des risques et l’élimination correcte des cultures doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
