यह विधि क्लेबसिएला क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती है, जैसे कि कैप्सूल और संबंधित उग्र को विनियमित करने के लिए कौन से जीन का उपयोग किया जाता है। इस तकनीक के मुख्य फायदे यह हैं कि यह शारीरिक रूप से अलग-अलग कैप्सुलेटेड और गैर-कैप्सुलेटेड उपभेदों का साधन प्रदान करता है, और इसका उपयोग कैप्सूल उत्पादन के उपभेदों के बीच तेजी से तुलना के लिए भी किया जा सकता है। हालांकि इस विधि को क्लेबसिला में कैप्सूल विनियमन का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था, लेकिन इसे विभिन्न जीवाणु प्रजातियों पर भी लागू किया जा सकता है।
आम तौर पर जो व्यक्ति इस विधि के लिए नए हैं, वे संघर्ष करेंगे क्योंकि ग्रेडिएंट डालना और कोशिकाओं को ढाल में जोड़ना काफी मुश्किल हो सकता है। इस विधि का दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है, क्योंकि हम उन तकनीकों को दिखाते हैं जो मास्टर करना मुश्किल है, उपयोगकर्ता की मदद करने के लिए सुझाव और सुझाव प्रदान करते हैं। शुरू करने के लिए, एक बाँझ पाश के साथ एक स्टॉक प्लेट से एक कॉलोनी का चयन करें, और एक उपयुक्त शोरबा के 10 मिलीलीटर टीका लगाओ।
रातोंरात संस्कृति को इनक्यूबेट करें। फिर संस्कृति को 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें। इसके बाद, सुपरनेट को त्यागें, और पीबीएस के दो मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।
अपकेंद्रित्र दोहराएं, और परिणामी सुपरनेट को त्यागें। फिर पीबीएस के दो मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। घनत्व ढाल कमजोर पड़ने बनाने के लिए, पीबीएस के साथ घनत्व ढाल माध्यम गठबंधन।
फिर प्रत्येक ढाल कमजोर पड़ने के 600 माइक्रोलीटर को व्यक्तिगत दो मिलीलीटर ट्यूबों में डालें। 200 माइक्रोलीटर पिपेट के साथ कोशिकाओं के 100 माइक्रोलीटर लें, और कई ढालों में से एक के मेनिस्कस के ठीक नीचे ट्यूब के किनारे पिपेट टिप रखें। बैक्टीरियल कोशिकाओं को बहुत धीरे-धीरे ढाल पर जाता है, जिससे इंटरफ़ेस को मिलाने का ध्यान नहीं जाता है।
8, 000 ग्राम पर 10 मिनट के लिए तैयार ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। इसके बाद, ढाल परत के ठीक ऊपर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए आवश्यक न्यूनतम ढाल कमजोर पड़ने की कल्पना करने के लिए ट्यूबों को रैक में स्थानांतरित करें। सबसे पहले, सबसे पतला घनत्व ढाल कमजोर पड़ने के एक मिलीलीटर को पांच मिलीलीटर राउंड-बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें।
1.5 इंच सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग करना, अगले सबसे केंद्रित घनत्व ढाल का एक मिलीलीटर लें। सुई को ट्यूब के नीचे रखें और सिरिंज की सामग्री को बहुत धीरे-धीरे इंजेक्ट करें। घनत्व ढाल के प्रत्येक चरण में एक स्पष्ट इंटरफेस होना चाहिए।
यदि परतें मिश्रण करती हैं, तो आप अपने बैक्टीरिया के स्वच्छ पृथक्करण को प्राप्त नहीं करेंगे। ढाल से सुई को धीरे-धीरे हटा दें ताकि ढाल कमजोर पड़ने के बीच इंटरफेस को परेशान न किया जा सके। इसके बाद ट्यूब को रैक में रखें।
ध्यान से तैयार कोशिकाओं के 600 माइक्रोलीटर को ट्यूब में ढाल के शीर्ष पर जोड़ें। फिर ट्यूब को एक ट्यूब एडाप्टर में रखें, और संतुलन सुनिश्चित करने के लिए एडाप्टर के साथ ट्यूब का वजन करें। इसके बाद, ट्यूब एडाप्टर को बेंच-टॉप सेंट्रलाइज के भीतर एक निश्चित कोण रोटर में रखें, और ट्यूब को 30 मिनट के लिए 3, 000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
अंत में, अपकेंद्रित्र के बाद, ट्यूब को ध्यान से हटा दें, इसे रैक में रखें, और परिणामों की तस्वीर दें। इस प्रोटोकॉल में, घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र का उपयोग बैक्टीरियल उपभेदों को अलग करने के लिए किया गया था ताकि वे कितना कैप्सूल उत्पादन करते हैं। हालांकि सटीक परिणाम बैक्टीरियल प्रजातियों पर निर्भर करते हैं, अधिकांश उपभेदों ढाल के भीतर एक ही स्थान पर स्थानांतरित हो जाएगा ।
एक जीवाणु उत्परिवर्ती पुस्तकालय के लिए इस विधि के आवेदन ढाल के ऊपर एक प्रमुख बैंड, ढाल की ऊपरी परत के माध्यम से एक कम घने बैंड का उत्पादन करना चाहिए, और नीचे एक मामूली acapsular अंश । इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि ढाल इंटरफेस को मिश्रित नहीं किया जाना चाहिए, और ढाल में हवा के बुलबुले नहीं होने चाहिए। प्रक्रिया के बाद, कैप्सूल की मात्रा की जांच करने के लिए यूरोनिक एसिड परख या माइक्रोस्कोपी जैसे सत्यापन विधियों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
नए उपभेदों के लिए इस तकनीक का उपयोग करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। यह न भूलें कि हैज़र्ड ग्रुप 2 रोगजनकों के साथ काम करना खतरनाक हो सकता है। इस प्रक्रिया को करते समय सुधारात्मक सुरक्षात्मक उपकरण, जोखिम आकलन का पालन करने और संस्कृतियों को सही ढंग से निपटाने जैसी सावधानियां हमेशा ली जानी चाहिए ।