Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i Klebsiella-feltet, for eksempel hvilke gener som brukes til å regulere kapsel og tilhørende virulents. De viktigste fordelene med denne teknikken er at det gir et middel til å fysisk skille kapsulerte og ikke-kapsulerte stammer, og den kan også brukes til raske sammenligninger mellom stammer av kapselproduksjon. Selv om denne metoden ble utviklet for å studere kapselregulering i Klebsiella, kan den også brukes på forskjellige bakterielle arter.
Vanligvis vil personer som er nye på denne metoden slite fordi det kan være ganske vanskelig å helle gradientene og legge cellene til graderingene. Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk, da vi viser teknikkene som er vanskelige å mestre, og gir forslag og tips for å hjelpe brukeren. Til å begynne med velger du en enkelt koloni fra en lagerplate med en steril løkke, og inokulerer 10 milliliter av en passende kjøttkraft.
Inkuber kulturen over natten. Deretter overføre kulturen til en 15 milliliter tube, og sentrifuge. Deretter kaster du supernatanten, og re-suspendere pellet i to milliliter pbs.
Gjenta sentrifugeringen, og kast den resulterende supernatanten. Deretter re-suspendere pellet i to milliliter pbs. Hvis du vil opprette tetthetsgradientfortynninger, kombinerer du gradientmed tetthet med PBS.
Deretter aliquot 600 mikroliter av hver gradient fortynning i individuelle to milliliter rør. Ta opp 100 mikroliter celler med en 200 mikroliter pipette, og plasser pipettespissen på siden av røret like under menisken til en av de mange gradientene. Aspirer bakteriecellene på gradienten veldig sakte, og ta vare på å ikke blande grensesnittet.
Sentrifuger de tilberedte rørene i 10 minutter ved 8000 g. Etter dette overfører du rørene til et stativ for å visualisere minimum gradientfortynning som kreves for å beholde cellene like over graderingslaget. Først overfører du en milliliter av den mest fortynnede tetthetsgradientfortynningen til et fem milliliter rund bunnrør.
Bruk en sprøyte med en 1,5 tommers nål, ta opp en milliliter av den nest mest konsentrerte tetthetsgradienten. Plasser nålen nederst på røret og injiser innholdet i sprøyten veldig sakte. Det må være et klart grensesnitt i hvert trinn i tetthetsgradienten.
Hvis lagene blandes, vil du ikke oppnå ren separasjon av bakteriene dine. Fjern nålen forsiktig fra graderingen for ikke å forstyrre grensesnittet mellom graderingsfortynningene. Plasser deretter røret i et stativ.
Tilsett forsiktig 600 mikroliter av de tilberedte cellene til toppen av gradienten i røret. Plasser deretter røret i en røradapter, og veie røret med adapteren for å sikre balanse. Etter dette plasserer du røradapteren i en fast vinkelrotor i en sentrifuge på benken, og sentrifuger røret i 30 minutter ved 3 000 g.
Til slutt, etter sentrifugering, fjern røret forsiktig, legg det i et stativ og fotografer resultatene. I denne protokollen ble tetthetsgradering sentrifugering brukt til å skille bakteriestammer basert på hvor mye kapsel de produserer. Selv om de eksakte resultatene avhenger av bakterieartene, vil de fleste stammer migrere til ett sted innenfor gradienten.
Anvendelse av denne metoden til et bakteriell mutantbibliotek bør produsere et stort bånd over gradienten, et mindre tett bånd gjennom det øverste laget av gradienten, og en mindre acapsulær brøkdel nederst. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske at gradient grensesnittene ikke skal blandes, og gradienten bør ikke inneholde luftbobler. Etter prosedyren bør valideringsmetoder som uronic acid analyse eller mikroskopi utføres for å undersøke kapselmengder.
Dette er spesielt viktig når du bruker denne teknikken for nye stammer. Ikke glem at det kan være farlig å jobbe med Hazard Group 2 patogener. Forholdsregler som korrigerende verneutstyr, følge risikovurderinger og avhending av kulturer riktig bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.