Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области Klebsiella, например, какие гены используются для регулирования капсулы и связанных с ними вирулентов. Основными преимуществами этого метода является то, что он обеспечивает средства для физически отдельных капсул и не-капсулированных штаммов, а также может быть использован для быстрого сравнения между штаммами капсулы производства. Хотя этот метод был разработан для изучения регуляции капсул в Klebsiella, он также может быть применен к различным видам бактерий.
Как правило, люди, которые являются новыми для этого метода будет бороться, потому что заливка градиентов и добавление клеток градиентов может быть довольно трудно. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как мы показываем методы, которые трудно освоить, предоставляя предложения и советы, чтобы помочь пользователю. Для начала выберите одну колонию из бульонной тарелки со стерильной петлей и прививка 10 миллилитров соответствующего бульона.
Инкубировать культуру в одночасье. Затем перенесите культуру на 15 миллилитровую трубку и центрифугу. Затем отбросьте супернатант и повторно приостановьте гранулы в двух миллилитров PBS.
Повторите центрифугирование и отбросьте полученный супернатант. Затем повторно приостановить гранулы в двух миллилитров PBS. Для создания разбавления градиента плотности объедините градиентную среду плотности с PBS.
Затем aliquot 600 микролитров каждого градиентного разбавления в отдельные две миллилитровые трубки. Возьмите 100 микролитров клеток с 200 микролитровым пипеткой, и поместите наконечник пипетки на стороне трубки чуть ниже мениска одного из многих градиентов. Аспирировать бактериальные клетки на градиент очень медленно, заботясь, чтобы не смешивать интерфейс.
Центрифуга подготовленных трубок в течение 10 минут при 8000 г. После этого перенесите трубки на стойку, чтобы визуализировать минимальное разбавление градиента, необходимое для удержания ячеек чуть выше градиентного слоя. Во-первых, перенесите один миллилитр наиболее разбавленного градиентного разбавления плотности в пятими миллилитровую круглую нижнюю трубку.
Используя шприц с 1,5-дюймовой иглой, возьмите один миллилитр следующего наиболее концентрированного градиента плотности. Поместите иглу в нижней части трубки и вводить содержимое шприца очень медленно. На каждом этапе градиента плотности должен быть четкий интерфейс.
Если слои смешиваются, вы не достигнете чистого разделения бактерий. Снимите иглу с градиента осторожно, чтобы не нарушить интерфейс между разбавлениями градиента. Затем поместите трубку в стойку.
Аккуратно добавьте 600 микролитров подготовленных ячеек к верхней части градиента в трубке. Затем поместите трубку в трубку адаптер, и взвесить трубку с адаптером для обеспечения баланса. После этого поместите адаптер трубки в ротор с фиксированным углом в центрифугу со скамейкой и центрифуга в течение 30 минут при 3000 г.
Наконец, после центрифугации, удалите трубку тщательно, поместите его в стойку, и сфотографировать результаты. В этом протоколе, центрифугация градиента плотности была использована для того чтобы отделить бактериальные напряжения основанные на насколько капсулы они производят. Хотя точные результаты зависят от бактериальных видов, большинство штаммов будет мигрировать в одном месте в градиенте.
Применение этого метода в библиотеке бактериальных мутантов должно производить основную полосу выше градиента, менее плотную полосу через верхний слой градиента и незначительную акапсулярную фракцию внизу. При попытке этой процедуры, важно помнить, что градиентные интерфейсы не должны быть смешанными, и градиент не должен содержать пузырьки воздуха. После процедуры, методы проверки, такие как анализ мочевой кислоты или микроскопии должны быть выполнены для изучения капсулы количества.
Это особенно важно при использовании этого метода для новых штаммов. Не забывайте, что работа с патогенами Hazard Group 2 может быть опасной. При выполнении этой процедуры всегда следует принимать такие меры предосторожности, как корректирующее защитное оборудование, соблюдение оценок риска и правильное удаление культур.
