Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for T-celle immunologi og udvikling af virale vektor vacciner. Den største fordel ved denne metode er, at kun små mængder blod er nødvendige, som giver mulighed for gentagne målinger fra den samme mus. Derudover kan virus- og transgenespecifikke CTL'er detekteres fra den samme prøve.
Demonstration af proceduren vil være Jasmine Rinnofner, en tekniker, og Annika Rossler, en grad studerende. Måling og analyse af prøverne vil være Zoltan Banki, en post-doc. Til at begynde, sikkert begrænse en mus i henhold til tekstprotokollen.
Saml 20 mikroliter blod i et EDTA-belagt rør fra en mus' haleåre. Når du arbejder med miltcytter, isolere milten og bruge stemplet af en sprøjte til at presse vævet gennem en celle si. Efter at have udført lysis på erythrocytterne, tælle cellerne og justere koncentrationen af prøven.
Der klargør og etiketter et Facs-rør til hver prøve, og overfør 100 mikroliter af organaffjedring eller 20 mikroliter blod til røret. Når du arbejder med miltcytter, centrifuge organ suspension i fem minutter, og kassér supernatant. Derefter vortex røret til at resuspendre cellen pellet.
For hver kanal, der skal anvendes, skal du også forberede et Facs-rør til en kompensationsprøve. Forbered endnu en prøve som et ukontrolleret kontrolelement. Forbered et rør med Facs buffere med tetramers på deres optimale fortyndinger, og vortex at blande.
Dernæst tilsættes 50 mikroliter af tetramerfortyndingen til hver prøve og vortex til at blande. Tilføj Facs-buffer uden tetramers til kompensationskontrollerne og den ikke-ained prøve. Dernæst inkubere prøverne i mørke forhold ved 37 grader Celsius i 20 minutter.
Mens prøverne inkuberes, tilsættes Facs buffer til et rør. Derefter tilsættes antistofferne til bufferen i henhold til de fortyndinger, der er angivet i tabel 2 i tekstprotokollen, og vortex opløsningen. I tvivl om det videnskabelige spørgsmål er markørkombinationer, bortset fra den, der er beskrevet her, kan anvendes.
Sørg for altid at inkludere antistoffer mod CD3 og CD8 i panelet. For hver kanal, forberede et rør med 200 mikroliter af Facs buffer, og tilsæt en mikroliter af et antistof fortynding mod CD8 i deres respektive farve, og vortex at blande. Gem derefter antistoffortyndingerne som angivet i tekstprotokollen.
For at vaske prøverne, tilføje en mililiter af Facs buffer til prøverne og centrifuge. Derefter kasseres supernatant, og dræne eventuelle resterende væske med papirservietter. Når du arbejder med blod, skal du være forsigtig, når du dræner resterende væske.
Før lysis af erythrocytter, blodet vil ikke holde sig til bunden af røret. Alternativt kan du aspirere supernatant. Dernæst tilsættes 50 mikroliter af antistofopløsningen til hver cellepellet og vortex forsigtigt.
Tilføj 50 mikroliter af hver kompensationsblanding til den tilsvarende kompensationskontrol og 50 mikroliter Facs-buffer til cellepillerne i den uhæmmede kontrol og vortex forsigtigt. Når der arbejdes med miltcytter, vaskes prøverne efter antistoffarvning direkte med en til to milliliter Facs buffer og centrifugeres i fem minutter. Derefter kasseres supernatant og afløb den resterende væske på papirservietter.
Tilføj 500 mikroliter af ACK buffer til hver blodprøve, og vortex forsigtigt. Derefter inkuberes prøverne i mørke i fem minutter ved stuetemperatur. Tilføj en milliliter Facs buffer til prøverne, og centrifuge.
Derefter kasseres supernatant og dræne eventuelle resterende væske med papirservietter. Korrekt lysis af erythrocytter er et afgørende skridt til at lette Facs måling, derfor, når pellet er temmelig våd, gentag lysis af erythrocytter. Prøverne vaskes igen som tidligere beskrevet.
Derefter kasseres supernatant og dræne eventuelle resterende væske på en køkkenrulle. Før fiksering skal du sørge for, at cellerne er godt resuspenderet for at forhindre dannelse af klumper. Tilføj 150 til 300 mikroliter af Facs fastsættelse buffer til hvert rør, og vortex at blande.
Fortsæt derefter med flowcytometrisk måling så hurtigt som muligt. For det første skal du måle kompensationskontrollen og korrigere for eventuelle spektrale overlapninger. Derefter skal du oprette sekventielle porte for at vælge til CD3-positive og CD8-positive celler.
Gate på lymfocytter ved hjælp af fremad og sidead scatter område. Derefter, inden for lymfocytpopulationen, gate på enkelte celler ved hjælp af fremad scatter bredde versus område. Brug CD3- og CD8-kanaler til at afbilde encellede lymfocytter.
Identificer CD8-positive T-celler ved at gating på CD3-positive og CD8-positive celler. Sørg for, at CD8-lave celler er inkluderet i gating. Overførsel på CD3/CD8-positive celler er et kritisk trin i denne protokol.
Da aktivering af celler ofte fører til nedregulering af CD3 og/eller CD8, bør CD3/CD8-lave celler også medtages. Derefter afbildes cd8-positive celler i forhold til tetramercellerne, gating på cd8-positive/tetramer-positive celler. Hvis det er muligt, skal du optage 20.000 celler i cd3-positiv og CD8-positiv port for hver prøve.
Endelig skal du gemme målingerne som en FCS-fil. I denne protokol blev antigenspecifik CD8+T-celler kvantitativt påvist i blod- og vævsprøver. Efter gating cd3-positive og CD8-positive celler blev der identificeret tetramer-positive celler.
To forskellige tetramers blev kombineret i samme rør til farvning, hvilket giver mulighed for samtidig kvantificering af to forskellige CTL-specificiteter. Ved hjælp af denne protokol kan T-celleresponser fra den samme mus følges over tid, da der kun er behov for små mængder blod til hver måling. Derudover kan fænotyper af antigenspecifikke CTLs analyseres.
Mens du forsøger denne procedure, Er det vigtigt at undgå langvarige inkubation gange, da dette kan føre til internalisering af T-celle receptorer. Siden opdagelsen af tetramerteknologi er tetramerfarvning blevet et vigtigt redskab til T-celleanalyse og en bred vifte af anvendelser, som omfatter tetramers, der påløber. En lys fremtid for lyse tetramers.
