שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום אימונולוגיה של תאי T ופיתוח חיסונים וקטוריים ויראליים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי רק כמויות קטנות של דם נדרשים, אשר מאפשר מדידות חוזרות ונשנות מאותו עכבר. בנוסף, ניתן לזהות CTLs ספציפיים לווירוסים ולטרנדים מאותה דגימה.
הדגימו את ההליך יהיו יסמין רינופנר, טכנאית, ואניקה רוסלר, סטודנטית לתואר שני. מדידה וניתוח הדגימות יהיה זולטן בנקי, פוסט-דוק. כדי להתחיל, לרסן בבטחה עכבר על פי פרוטוקול הטקסט.
לאסוף 20 microliters של דם בצינור מצופה EDTA מוריד הזנב של עכבר. כאשר עובדים עם טחול, לבודד את הטחול ולהשתמש הבוכנה של מזרק ללחוץ על הרקמה דרך מסננת התא. לאחר ביצוע תזה על אריתרוקיטים, לספור את התאים ולהתאים את הריכוז של המדגם.
הכינו ותייגו צינור Facs אחד עבור כל דגימה, והעברת 100 מיקרוליטרים של השעיית איברים, או 20 מיקרוליטרים של דם לצינור. כאשר עובדים עם טחול, צנטריפוגה השעיית האיבר במשך חמש דקות, ולהשליך את supernatant. לאחר מכן, מערבולת הצינור כדי resuspend גלולת התא.
לשימוש בכל ערוץ, הכינו גם צינור Facs לדגימה של פיצוי. הכן דוגמה נוספת אחת כפקד לא מזוהם. הכינו צינור עם מאגרי פאקס עם ת'רמרים בדילול האופטימלי שלהם, ומערבולת לערבב.
לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של דילול הטטרמר לכל דגימה, ומערבולת לערבב. הוסף מאגר Facs ללא tetramers לפקדי הפיצוי ולדגימה שאינה מוכתמת. לאחר מכן, הדגירה את הדגימות בתנאים כהים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
בעוד הדגימות דגירה, להוסיף חיץ Facs לצינור. לאחר מכן, הוסף את הנוגדנים למאגר בהתאם לדילולים שצוינו בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט, ומערבולת הפתרון. תלויים ועומדים בשאלה המדעית ניתן להשתמש בשילובי הסמן, מלבד זה המתואר כאן.
הקפד תמיד לכלול נוגדנים נגד CD3 ו- CD8 בלוח. עבור כל ערוץ, להכין צינור עם 200 microliters של חיץ Facs, ולהוסיף microliters אחד של דילול נוגדנים נגד CD8 בצבע שלהם, ומערבולת לערבב. לאחר מכן, אחסן את דילול הנוגדנים כפי שצוין בפרוטוקול הטקסט.
כדי לשטוף את הדגימות, להוסיף מיליטר אחד של מאגר Facs לדגימות וצנטריפוגה. לאחר מכן, להשליך את supernatant, ולנקות כל נוזל שנותר עם מגבות נייר. כאשר עובדים עם דם, להיות זהיר בעת ניקוז את הנוזל שנותר.
לפני תזה של אריתרוציטים, הדם לא ידבק לתחתית הצינור. לחלופין, אתה יכול לספירה על טבעי. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של תותר הנוגדנים לכל גלולת תא, ומערבולת בעדינות.
הוסף 50 מיקרוליטרים של כל תערובת פיצוי לבקרת הפיצויים המתאימה, ו- 50 מיקרוליטרים של מאגר Facs לכדור התא של הפקד הבלתי נגוע, ומערבולת בעדינות. כאשר עובדים עם טחול, לשטוף את הדגימות לאחר כתמי נוגדן ישירות עם אחד עד שני מיליליטר של חיץ Facs, וצנטריפוגה במשך חמש דקות. לאחר מכן, השלך את העל-טבעי ורוקן את הנוזל הנותר על מגבות נייר.
הוסף 500 מיקרוליטרים של חיץ ACK לכל דגימת דם, ומערבולת בעדינות. לאחר מכן, הדגירה את הדגימות בחושך במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוסף מיליליטר אחד של מאגר Facs לדגימות, וצנטריפוגה.
לאחר מכן, השלך את העל-טבעי ורוקן כל נוזל שנותר במגבות נייר. תזה נכונה של אריתרוקיטים היא צעד מכריע כדי להקל על מדידת Facs, ולכן, כאשר גלולה הוא רטוב למדי, לחזור על תזה של אריתרוקיטים. לשטוף את הדגימות שוב כפי שתואר קודם לכן.
לאחר מכן, השלך את העל-טבעי ורוקן את כל הנוזלים הנותרים על מגבת נייר. לפני קיבעון, ודא כי התאים הם resuspended היטב על מנת למנוע היווצרות של גושים. הוסף 150 עד 300 מיקרוליטרים של מאגר תיקון Facs לכל צינור, ומערבולת לערבב.
לאחר מכן, המשך עם מדידה ציטומטרית זרימה מהר ככל האפשר. ראשית, למדוד את פקדי הפיצוי ולתקן עבור כל חפיפות ספקטרליות. לאחר מכן, הגדר שערים רציפים לבחירה עבור תאים חיוביים ל- CD3 ותאי CD8 חיוביים.
שער על הלימפוציטים באמצעות אזור פיזור קדימה וצד. לאחר מכן, בתוך אוכלוסיית הלימפוציטים, שער על תאים בודדים באמצעות רוחב פיזור קדימה לעומת שטח. השתמש בערוצי CD3 ו- CD8 כדי להתוות לימפוציטים חד-תאיים.
זהה תאי T חיוביים ל- CD8, על-ידי הפעלה בתאים חיוביים ל- CD3 ו- CD8 חיוביים. ודא שתאים נמוכים ל- CD8 כלולים ב- gating. הפצה בתאים חיוביים ל- CD3/CD8 היא שלב קריטי בפרוטוקול זה.
מכיוון שהפעלת תאים מובילה לעתים קרובות לרגולציה נמוכה יותר של CD3 ו/או CD8, יש לכלול גם תאים נמוכים ב- CD3/CD8. לאחר מכן, התווה את התאים החיוביים ל- CD8 לעומת תאי הטטרמר, תוך גת על התאים החיוביים/טטרמר CD8. במידת האפשר, הקלט 20, 000 תאים בשער CD3 חיובי ו- CD8 חיובי עבור כל דגימה.
לבסוף, שמור את המידות כקובץ FCS. בפרוטוקול זה, תאי CD8+T ספציפיים לאנטיגן זוהו כמותית בדגימות דם ורקמות. לאחר אתחול התאים החיוביים ל-CD3 ותאי CD8 חיוביים, זוהו תאים חיוביים לטטמר.
שני tetramers שונים שולבו באותו צינור עבור כתמים, המאפשר כימות בו זמנית של שני ספציפיות CTL שונים. באמצעות פרוטוקול זה, תגובות תא T מאותו עכבר ניתן לעקוב לאורך זמן, כמו רק כמויות קטנות של דם נדרשים עבור כל מדידה. בנוסף, ניתן לנתח פנוטיפים של CTLs ספציפיים לאנטיגן.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב להימנע פעמים דגירה ממושכת, כמו זה יכול להוביל להפנמה של קולטני תא T. מאז גילוי טכנולוגיית הטטרמר, כתמי טטרמר הפכו לכלי חיוני לניתוח תאי T, ומגוון רחב של יישומים, הכוללים צבירת טטרמרים. עתיד מזהיר לתמרים בהירים.
