विरोधी के एक साथ ठहराव वेक्टर और विरोधी transgene-विशिष्ट सीडी 8⁺ टी कोशिकाओं के माध्यम से MHC मैं एक वायरल वेक्टर के साथ टीकाकरण के बाद दाग Tetramer

यह विधि टी-सेल इम्यूनोलॉजी और वायरल वेक्टर टीकों के विकास के क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है। इस विधि का मुख्य लाभ यह है कि केवल थोड़ी मात्रा में रक्त की आवश्यकता होती है, जो एक ही माउस से दोहराए गए माप की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, एक ही नमूने से वायरस और ट्रांसजीन-विशिष्ट सीटीएल का पता लगाया जा सकता है।

प्रक्रिया का प्रदर्शन चमेली Rinnofner, एक तकनीशियन, और Annika Rossler, एक स्नातक छात्र होगा । नमूनों को मापने और विश्लेषण Zoltan बांकी, एक के बाद डॉक्टर होगा । शुरू करने के लिए, पाठ प्रोटोकॉल के अनुसार माउस को सुरक्षित रूप से नियंत्रित करें।

माउस की पूंछ की नस से एक EDTA-लेपित ट्यूब में रक्त के 20 माइक्रोलीटर ले लीजिए। स्प्लेनोसाइट्स के साथ काम करते समय, तिल्ली को अलग करें और एक सिरिंज के प्लंजर का उपयोग कोशिका छलनी के माध्यम से ऊतक को दबाने के लिए करें। एरिथ्रोसाइट्स पर लाइसिस करने के बाद, कोशिकाओं की गणना करें और नमूने की एकाग्रता को समायोजित करें।

प्रत्येक नमूने के लिए एक Facs ट्यूब तैयार करें और लेबल करें, और अंग निलंबन के 100 माइक्रोलीटर, या 20 माइक्रोलीटर रक्त को ट्यूब में स्थानांतरित करें। स्प्लेनोसाइट्स के साथ काम करते समय, अंग निलंबन को पांच मिनट तक अपकाइज करें, और सुपरनेट को त्यागें। फिर, सेल पेलेट को फिर से इवल करने के लिए ट्यूब को भंवर दें।

प्रत्येक चैनल का उपयोग करने के लिए, मुआवजे के नमूने के लिए एक Facs ट्यूब भी तैयार करें। एक दाग नियंत्रण के रूप में एक अतिरिक्त नमूना तैयार करें। अपने इष्टतम कमजोर पड़ने पर टेट्रामर्स के साथ Facs बफ़र्स के साथ एक ट्यूब तैयार करें, और मिश्रण करने के लिए भंवर।

इसके बाद, प्रत्येक नमूने में टेट्रामर कमजोर पड़ने के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें, और मिश्रण करने के लिए भंवर। मुआवजा नियंत्रण और अन दाग नमूने के लिए टेट्रामर्स के बिना Facs बफर जोड़ें। इसके बाद, 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे परिस्थितियों में नमूनों को इनक्यूबेट करें।

जबकि नमूने इनक्यूबेट, एक ट्यूब के लिए Facs बफर जोड़ें । फिर, पाठ प्रोटोकॉल की तालिका 2 में निर्दिष्ट कमजोरुओं के अनुसार बफर में एंटीबॉडी जोड़ें, और समाधान भंवर। वैज्ञानिक प्रश्न पर लंबित मार्कर संयोजन हैं, इसके अलावा यहां वर्णित एक से, इस्तेमाल किया जा सकता है ।

पैनल में सीडी 3 और सीडी 8 के खिलाफ एंटीबॉडी हमेशा शामिल करना सुनिश्चित करें। प्रत्येक चैनल के लिए, Facs बफर के 200 माइक्रोलीटर के साथ एक ट्यूब तैयार करें, और अपने संबंधित रंग में सीडी 8 के खिलाफ एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के एक माइक्रोलीटर जोड़ें, और मिश्रण करने के लिए भंवर। फिर, टेक्स्ट प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की दुकान करें।

नमूनों को धोने के लिए, नमूनों और अपकेंद्रित्र में Facs बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें। फिर, सुपरनेट को त्यागें, और पेपर तौलिए के साथ किसी भी शेष तरल को छान लें। रक्त के साथ काम करते समय, शेष तरल को निकालते समय सतर्क रहें।

एरिथ्रोसाइट्स के लाइसिस से पहले, रक्त ट्यूब के नीचे से चिपकेगा नहीं। वैकल्पिक रूप से, आप सुपरनेट को एस्पिरेट कर सकते हैं। इसके बाद, प्रत्येक सेल पेलेट में एंटीबॉडी समाधान के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें, और भंवर धीरे से।

प्रत्येक मुआवजा मिश्रण के 50 माइक्रोलीटर को संबंधित मुआवजा नियंत्रण में जोड़ें, और Facs बफर के 50 माइक्रोलीटर को अन दागदार नियंत्रण के सेल पेलेट में, और भंवर धीरे से। स्पेनोसाइट्स के साथ काम करते समय, एंटीबॉडी के बाद नमूनों को सीधे एक से दो मिलीलीटर Facs बफर के साथ धोएं, और पांच मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें। फिर, सुपरनेट को त्यागें और शेष तरल को कागज के तौलिए पर छान लें।

प्रत्येक रक्त नमूने में ACK बफर के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, और भंवर धीरे से। इसके बाद कमरे के तापमान पर पांच मिनट तक अंधेरे में नमूनों को इनक्यूबेट करें। नमूनों में Facs बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें, और अपकेंद्रित्र।

फिर, सुपरनेट को त्यागें और किसी भी बचे हुए तरल पदार्थ को कागज के तौलिए से निकाल दें। एरिथ्रोसाइट्स का उचित लाइसिस Facs माप की सुविधा के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, इसलिए, जब गोली बल्कि गीला है, एरिथ्रोसाइट्स की लाइसिस दोहराएं। नमूनों को फिर से धोएं जैसा कि पहले वर्णित है।

फिर, सुपरनेट को त्यागें और किसी भी बचे हुए तरल पदार्थ को कागज के तौलिया पर छान लें। निर्धारण से पहले, सुनिश्चित करें कि झुरमुट के गठन को रोकने के लिए कोशिकाओं को अच्छी तरह से निलंबित कर दिया जाता है। प्रत्येक ट्यूब में बफर फिक्सिंग Facs के 150 से 300 माइक्रोलीटर जोड़ें, और मिश्रण करने के लिए भंवर।

फिर, जितनी जल्दी हो सके प्रवाह साइटोमेट्रिक माप के साथ आगे बढ़ें। सबसे पहले, किसी भी स्पेक्ट्रल ओवरलैप के लिए मुआवजा नियंत्रण और सही उपाय करें। बाद में, CD3-सकारात्मक और सीडी 8-सकारात्मक कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए अनुक्रमिक द्वार स्थापित करें।

आगे और साइडवर्ड स्कैटर एरिया का उपयोग करके लिम्फोसाइट्स पर गेट। फिर, लिंफोसाइट आबादी के भीतर, क्षेत्र बनाम आगे स्कैटर चौड़ाई का उपयोग करके एकल कोशिकाओं पर गेट। एकल सेल लिम्फोसाइट्स को प्लॉट करने के लिए सीडी 3 और सीडी 8 चैनलों का उपयोग करें।

CD3-पॉजिटिव और सीडी 8-पॉजिटिव सेल्स पर गेटिंग करके सीडी 8-पॉजिटिव टी-सेल्स की पहचान करें । सुनिश्चित करें कि सीडी 8-कम कोशिकाओं को गेटिंग में शामिल किया गया है। CD3/CD8-positive कोशिकाओं पर प्रचार इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है ।

कोशिकाओं के सक्रियण के रूप में अक्सर CD3 और/या CD8 के विनियमन नीचे की ओर जाता है, CD3/CD8-कम कोशिकाओं को भी शामिल किया जाना चाहिए । इसके बाद, सीडी 8-पॉजिटिव कोशिकाओं बनाम टेट्रामर कोशिकाओं को प्लॉट करें, सीडी 8-पॉजिटिव/टेट्रामर पॉजिटिव कोशिकाओं पर गेटिंग करें । यदि संभव हो, तो प्रत्येक नमूने के लिए सीडी 3-पॉजिटिव और सीडी 8-पॉजिटिव गेट में 20, 000 कोशिकाओं को रिकॉर्ड करें।

अंत में, माप को एफसीएस फ़ाइल के रूप में सहेजें। इस प्रोटोकॉल में, रक्त और ऊतक के नमूनों में एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी-कोशिकाओं का मात्रात्मक रूप से पता लगाया गया था। सीडी 3-पॉजिटिव और सीडी 8 पॉजिटिव सेल्स को गेटिंग करने के बाद टेट्रामर पॉजिटिव सेल्स की पहचान की गई ।

दो अलग-अलग टेट्रामर्स को एक ही ट्यूब में धुंधला करने के लिए जोड़ा गया था, जिससे दो अलग-अलग सीटीएल विशिष्टताओं के एक साथ मात्राकरण की अनुमति मिली। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, एक ही माउस से टी-सेल प्रतिक्रियाओं का समय के साथ पालन किया जा सकता है, क्योंकि प्रत्येक माप के लिए केवल छोटी मात्रा में रक्त की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, एंटीजन-विशिष्ट सीटीएल के फेनोटाइप का विश्लेषण किया जा सकता है।

इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, लंबे समय तक इनक्यूबेशन बार बचना महत्वपूर्ण है, क्योंकि इससे टी-सेल रिसेप्टर्स का आंतरिककरण हो सकता है। टेट्रामर तकनीक की खोज के बाद से, टेट्रामर स्टेनिंग टी-सेल विश्लेषण के लिए एक आवश्यक उपकरण बन गया है, और अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है, जिसमें टेट्रामर्स अर्जित करना शामिल है। उज्ज्वल टेट्रामर्स के लिए एक उज्ज्वल भविष्य।