이 방법은 T 세포 면역학 및 바이러스 벡터 백신의 발달 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 동일한 마우스에서 반복 측정을 허용하는 소량의 혈액만 필요하다는 것입니다. 또한, 바이러스 및 유전자 특이적 CTL은 동일한 샘플에서 검출될 수 있다.
절차를 시연하는 것은 기술자인 재스민 린도피너와 대학원생 인 아니카 로슬러가 될 것입니다. 샘플을 측정하고 분석하는 것은 졸탄 뱅키( Zoltan Banki)입니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 안전하게 절제합니다.
마우스의 꼬리 정맥에서 EDTA 코팅 튜브에 20 마이크로리터의 혈액을 수집합니다. 비장구로 작업 할 때 비장을 분리하고 주사기의 플런저를 사용하여 세포 여과기를 통해 조직을 누릅니다. 적혈구에 용해를 수행 한 후, 세포를 계산하고 샘플의 농도를 조정합니다.
각 샘플에 대해 하나의 Facs 튜브를 준비하고 라벨을 붙이고, 100마이크로리터의 장기 현탁액 또는 20 마이크로리터의 혈액을 튜브로 이송합니다. 비장으로 작업 할 때, 원심 분리는 5 분 동안 장기 현탁액을 제거하고 상퍼를 폐기하십시오. 그런 다음 튜브를 소용돌이쳐 세포 펠릿을 재일시 중단합니다.
각 채널을 사용할 수 있도록 보상 샘플을 위해 Facs 튜브를 준비합니다. 스테인드 컨트롤로 한 개의 추가 샘플을 준비합니다. 최적의 희석제에 테트라머와 팩 버퍼와 튜브를 준비, 혼합 소용돌이.
다음으로, 각 샘플에 테트라머 희석제 50마이크로리터를 추가하고 소용돌이를 혼합합니다. 테트라머없이 Facs 버퍼를 보정 컨트롤과 스테인드되지 않은 샘플에 추가합니다. 다음으로, 어두운 조건에서 샘플을 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.
샘플이 인큐베이션하는 동안 튜브에 Facs 버퍼를 추가합니다. 이어서, 텍스트 프로토콜의 표 2에 지정된 희석제에 따라 완충제에 항체를 추가하고, 용액을 소용돌이시다. 과학적 질문에 보류 중인 마커 조합, 떨어져 여기에 설명 된 것 에서, 사용할 수 있습니다.
항상 패널에 CD3 및 CD8에 대한 항체를 포함해야 합니다. 각 채널에 대해, 200 마이크로리터의 Facs 버퍼로 튜브를 준비하고, 각각의 색상에 CD8에 대한 항체 희석제 1마이크로리터를 추가하고, 혼합하는 소용돌이를 추가한다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 지정된 바와 같이 항체 희석제를 저장합니다.
샘플을 세척하려면 샘플 및 원심 분리기에 Facs 버퍼 1mililiter를 추가합니다. 그런 다음 상체를 버리고 남은 액체를 종이 타월로 배출합니다. 혈액으로 작업 할 때, 남아있는 액체를 배출 할 때주의하십시오.
적혈구의 용해 이전에, 혈액은 관의 바닥에 충실하지 않습니다. 또는, 당신은 슈퍼 나탄을 흡인 할 수 있습니다. 다음으로, 각 세포 펠릿에 항체 용액의 50 마이크로리터를 추가하고 부드럽게 소용돌이를 넣습니다.
각 보상 믹스의 50 마이크로리터를 해당 보정 제어에 추가하고, 50 마이크로리터의 Facs 버퍼를 스테인드 컨트롤의 세포 펠릿에 넣고, 소용돌이를 부드럽게 넣습니다. 비장구로 작업할 때, 항체가 1~2밀리리터의 팩 버퍼, 원심분리기로 직접 염색한 후 샘플을 5분간 세척한다. 그런 다음 상체를 버리고 종이 타월에 남은 액체를 빼내십시오.
각 혈액 샘플에 500 마이크로리터의 ACK 버퍼를 추가하고 부드럽게 소용돌이를 추가합니다. 그런 다음 실온에서 5 분 동안 어둠 속에서 샘플을 배양합니다. 샘플 및 원심분리기에 Facs 버퍼 1밀리리터를 추가합니다.
그런 다음 상체를 버리고 남은 액체를 종이 타월로 배출합니다. 적혈구의 적절한 용해는 Facs 측정을 용이하게하는 중요한 단계이므로 펠릿이 다소 젖으면 적혈구의 용해를 반복합니다. 이전에 설명한 대로 샘플을 다시 세척합니다.
그런 다음 상체를 버리고 종이 타월에 남은 액체를 배출합니다. 고정하기 전에 덩어리형성을 방지하기 위해 세포가 잘 재주중단되어 있는지 확인하십시오. 각 튜브에 버퍼를 고정하는 Facs의 150~300마이크로리터를 추가하고 소용돌이를 혼합합니다.
그런 다음 가능한 한 빨리 유동 세포 측정을 진행합니다. 먼저 보상 컨트롤을 측정하고 스펙트럼 중복에 대해 수정합니다. 그 후 CD3 양성 및 CD8 양성 셀에 대해 선택하도록 순차 게이트를 설정합니다.
전방 및 측면 산란 영역을 사용하여 림프구의 게이트. 그런 다음 림프구 인구 내에서, 전방 분산 폭대 면적을 사용하여 단일 세포의 게이트. CD3 및 CD8 채널을 사용하여 단일 셀 림프구를 플롯합니다.
CD3 양성 및 CD8 양성 셀에 게이팅하여 CD8 양성 T 세포를 식별합니다. CD8-낮은 셀이 게이팅에 포함되어 있는지 확인합니다. CD3/CD8 양성 셀에서 전파하는 것은 이 프로토콜에서 중요한 단계입니다.
세포의 활성화는 종종 CD3 및/또는 CD8의 다운 조절으로 이어지기 때문에 CD3/CD8-낮은 세포도 포함되어야 합니다. 그 후, CD8 양성 세포 대 테트라머 세포를 플롯하여 CD8 양성/테트라머 양성 세포에서 게이팅합니다. 가능하면 각 샘플에 대해 CD3 양성 및 CD8 양성 게이트에서 20, 000 셀을 기록하십시오.
마지막으로 측정값을 FCS 파일로 저장합니다. 이 프로토콜에서, 항원 특이적 CD8+T 세포는 혈액 및 조직 샘플에서 정량적으로 검출되었다. CD3 양성 및 CD8 양성 세포를 게이팅한 후 테트라머 양성 세포가 확인되었습니다.
두 개의 서로 다른 테트라머는 염색을 위해 동일한 튜브에 결합되어 두 개의 서로 다른 CTL 특이성을 동시에 정량화할 수 있었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 각 측정에 소량의 혈액만 필요하므로 동일한 마우스의 T 세포 반응을 시간이 지남에 따라 추적할 수 있습니다. 또한 항원 특이적 CTL의 표현형을 분석할 수 있다.
이 절차를 시도하는 동안, 이것은 T 세포 수용체의 내재화로 이어질 수 있기 때문에 장기간 잠복기를 피하는 것이 중요합니다. 테트라머 기술이 발견된 이래, 테트라머 염색은 T 세포 분석을 위한 필수 도구이자 테트라머 를 포함한 광범위한 응용 분야가 되었습니다. 밝은 테트라머를 위한 밝은 미래.
