Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen T-celleimmunologi og utvikling av virusvektorvaksiner. Den største fordelen med denne metoden er at bare små mengder blod er nødvendig, noe som tillater gjentatte målinger fra samme mus. I tillegg kan virus- og transgenespesifikke CTLer oppdages fra samme prøve.
Viser prosedyren vil være Jasmine Rinnofner, en tekniker, og Annika Rossler, en grad student. Måling og analyse av prøvene vil være Zoltan Banki, en post-doc. For å begynne, trygt begrense en mus i henhold til tekstprotokollen.
Samle 20 mikroliter blod i et EDTA-belagt rør fra halen venen av en mus. Når du arbeider med miltytter, isolere milten og bruk stempelet på en sprøyte for å presse vevet gjennom en cellesil. Etter å ha utført lysis på erytrocytter, telle cellene og justere konsentrasjonen av prøven.
Forbered og merk ett Facs-rør for hver prøve, og overfør 100 mikroliter organsuspensjon, eller 20 mikroliter blod til røret. Når du arbeider med miltytter, sentrifuger organsuspensjonen i fem minutter, og kast det overnaturlige. Deretter virvler røret for å gjenopplive cellepelleten.
For hver kanal som skal brukes, må du også forberede et Facs-rør for en kompensasjonsprøve. Forbered en ekstra prøve som en uopphetet kontroll. Forbered et rør med Facs buffere med tetramers på optimale fortynninger, og vortex å blande.
Deretter legger du til 50 mikroliter tetramer fortynning til hver prøve, og vortex å blande. Legg til Facs-buffer uten tetramers i kompensasjonskontrollene og det uopphetede utvalget. Deretter inkubere prøvene under mørke forhold ved 37 grader Celsius i 20 minutter.
Mens prøvene inkubere, legg Facs buffer til et rør. Deretter legger antistoffene til bufferen i henhold til fortynningene som er angitt i tabell 2 i tekstprotokollen, og virvler løsningen. Venter på det vitenskapelige spørsmålet er markøren kombinasjoner, bortsett fra den som er beskrevet her, kan brukes.
Sørg for å alltid inkludere antistoffer mot CD3 og CD8 i panelet. For hver kanal, forberede et rør med 200 mikroliter facs buffer, og legge til en mikroliter av et antistoff fortynning mot CD8 i sin respektive farge, og vortex å blande. Deretter lagrer du antistofffortynningene som angitt i tekstprotokollen.
For å vaske prøvene, legg til en mililiter av Facs buffer til prøvene og sentrifuge. Deretter kast overnaturanten og tøm eventuell gjenværende væske med papirhåndklær. Når du arbeider med blod, vær forsiktig når du drenerer av gjenværende væske.
Før lysis av erytrocytter vil blodet ikke holde seg til bunnen av røret. Alternativt kan du aspirere det overnaturlige. Deretter legger du til 50 mikroliter av antistoffløsningen til hver cellepellet, og vortex forsiktig.
Legg til 50 mikroliter av hver kompensasjonsblanding til den tilsvarende kompensasjonskontrollen, og 50 mikroliter Facs-buffer til cellepelleten til den uopphetede kontrollen, og vortex forsiktig. Når du arbeider med miltytter, vask prøvene etter antistofffarging direkte med en til to milliliter Facs buffer, og sentrifuge i fem minutter. Deretter kast overnaturvæsken og tøm av den gjenværende væsken på papirhåndklær.
Tilsett 500 mikroliter ACK-buffer til hver blodprøve, og vortex forsiktig. Deretter inkubere prøvene i mørket i fem minutter ved romtemperatur. Legg til en milliliter Facs buffer i prøvene, og sentrifuge.
Deretter kast overnaturvæsken og tøm eventuell gjenværende væske med papirhåndklær. Riktig lysis av erytrocytter er et avgjørende skritt for å lette Facs måling, derfor, når pellet er ganske våt, gjenta lysis av erytrocytter. Vask prøvene igjen som tidligere beskrevet.
Deretter kast overnatanten og tøm eventuell gjenværende væske på et papirhåndkle. Før fiksering, sørg for at cellene er godt resuspended for å hindre dannelse av klumper. Tilsett 150 til 300 mikroliter facs festebuffer til hvert rør, og vortex å blande.
Fortsett deretter med strømningscytokometriske målinger så raskt som mulig. Mål først kompensasjonskontrollene og korriger for eventuelle spektrale overlappinger. Etterpå konfigurerer du sekvensielle porter for å velge for CD3-positive og CD8-positive celler.
Gate på lymfocytter ved hjelp av fremover og sidelengs scatter område. Deretter, innenfor lymfocyttpopulasjonen, gate på enkeltceller ved hjelp av fremover scatter bredde versus område. Bruk CD3- og CD8-kanaler til å plotte encellede lymfocytter.
Identifiser CD8-positive T-celler, ved å gi på CD3-positive og CD8-positive celler. Kontroller at CD8-lave celler er inkludert i gating. Overføring på CD3/CD8-positive celler er et kritisk skritt i denne protokollen.
Som aktivering av celler fører ofte til nedregulering av CD3 og / eller CD8, CD3 / CD8-lave celler bør også inkluderes. Etter dette plotter du CD8-positive celler versus tetramercellene, og gating på CD8-positive / tetramer-positive celler. Hvis mulig, ta opp 20 000 celler i CD3-positiv og CD8-positiv gate for hver prøve.
Til slutt lagrer du målingene som en FCS-fil. I denne protokollen ble antigenspesifikke CD8+T-celler kvantitativt oppdaget i blod- og vevsprøver. Etter gating CD3-positive og CD8-positive celler, ble tetramer-positive celler identifisert.
To forskjellige tetramers ble kombinert i samme rør for farging, noe som åpner for samtidig kvantifisering av to forskjellige CTL-spesifisiteter. Ved hjelp av denne protokollen kan T-cellesvar fra samme mus følges over tid, da bare små mengder blod er nødvendig for hver måling. I tillegg kan fenotyper av antigenspesifikke CTLer analyseres.
Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å unngå langvarig inkubasjonstider, da dette kan føre til internalisering av T-cellereseptorer. Siden oppdagelsen av tetramer teknologi, tetramer farging har blitt et viktig verktøy for T-celle analyse, og et bredt spekter av applikasjoner, som inkluderer tetramers påløp. En lys fremtid for lyse tetramers.
