Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom området T-cells immunologi och utveckling av virala vektorvacciner. Den största fördelen med denna metod är att endast små mängder blod behövs, vilket möjliggör upprepade mätningar från samma mus. Dessutom kan virus- och transgenspecifika CT:er upptäckas från samma prov.
Demonstrera förfarandet kommer att Jasmine Rinnofner, en tekniker, och Annika Rossler, en grad student. Att mäta och analysera proverna blir Zoltan Banki, en post-doc. Till att börja, säkert hålla fast en mus enligt textprotokollet.
Samla 20 mikroliter blod i ett EDTA-belagt rör från svansvenen på en mus. När du arbetar med splenocyter, isolera mjälte och använda kolven av en spruta för att trycka vävnaden genom en cell sil. Efter att ha utfört lys på erytrocyterna, räkna cellerna och justera koncentrationen av provet.
Förbered och märk en Facs-tub för varje prov, och överför 100 mikroliter av organupphängning, eller 20 mikroliter blod till röret. Vid arbete med splenocyter, centrifug organ suspensionen i fem minuter, och kassera supernatanten. Sedan, virvel röret för att återanvända cellpellets.
För varje kanal som ska användas, bered också ett Facs-rör för ett kompensationsprov. Förbered ytterligare ett prov som en obefläckad kontroll. Förbered ett rör med Facs buffertar med tetramers vid deras optimala utspädningar, och virvel att blanda.
Därefter lägger du till 50 mikroliter av tetramerutspädningen till varje prov, och virvel för att blanda. Lägg till Facs-buffert utan tetramers i kompensationskontrollerna och det ej uppsnövade provet. Därefter inkubera proverna i mörka förhållanden vid 37 grader Celsius i 20 minuter.
Medan proverna inkuberar, tillsätt Facs buffert till ett rör. Lägg sedan till antikropparna till bufferten enligt de utspädningar som anges i tabell 2 i textprotokollet, och vortexa lösningen. I väntan på den vetenskapliga frågan är markörkombinationerna, bortsett från den som beskrivs här, kan användas.
Se till att alltid inkludera antikroppar mot CD3 och CD8 i panelen. För varje kanal, förbereda ett rör med 200 mikroliter av Facs buffert, och tillsätt en mikroliter av en antikropp utspädning mot CD8 i deras respektive färg, och virvel att blanda. Sedan, lagra antikroppen utspädningar som anges i textprotokollet.
För att tvätta proverna, tillsätt en mililiter facs buffert till proverna och centrifug. Sedan, kasta supernatant, och dränera eventuella kvarvarande vätska med pappershanddukar. När du arbetar med blod, var försiktig när du dränerar bort återstående vätska.
Före lys av erytrocyter kommer blodet inte att fastna på botten av röret. Alternativt kan du aspirera supernatanten. Därefter lägger du till 50 mikroliter av antikroppslösningen till varje cellpellet, och virvel försiktigt.
Lägg till 50 mikroliter av varje kompensationsmix till motsvarande kompensationskontroll, och 50 mikroliter facs-buffert till cellpelleten på den ofläckiga kontrollen, och virvel försiktigt. Vid arbete med splenocyter, tvätta proverna efter antikroppsfärgning direkt med en till två milliliter Facs buffert, och centrifug i fem minuter. Sedan, kasta supernatant och dränera bort den återstående vätskan på hushållspapper.
Tillsätt 500 mikroliter av ACK buffert till varje blodprov, och virvel försiktigt. Därefter, inkubera proverna i mörker i fem minuter vid rumstemperatur. Tillsätt en milliliter Facs buffert till proverna, och centrifug.
Sedan, kasta supernatant och dränera eventuell kvarvarande vätska med pappershanddukar. Korrekt lys av erytrocyter är ett avgörande steg för att underlätta Facs mätning, därför, när pelleten är ganska våt, upprepa lythsis av erytrocyter. Tvätta proverna igen som tidigare beskrivits.
Sedan, kasta supernatant och dränera eventuell kvarvarande vätska på en pappershandduk. Före fixering, se till att cellerna är väl resuspended för att förhindra bildandet av klumpar. Lägg 150 till 300 mikroliter av Facs fästbuffert till varje rör, och virvel att blanda.
Fortsätt sedan med flödescytometrisk mätning så snabbt som möjligt. Först mäta kompensationskontrollerna och korrigera för eventuella spektrala överlappningar. Efteråt, ställa in sekventiella grindar för att välja för CD3-positiva och CD8-positiva celler.
Gate på lymfocyterna med hjälp av framåt och sidutstande scatter-området. Sedan, inom lymfocytpopulationen, gate på enstaka celler med hjälp av framåt scatter bredd kontra område. Använd CD3- och CD8-kanaler för att rita encelliga lymfocyter.
Identifiera CD8-positiva T-celler, genom gating på CD3-positiva och CD8-positiva celler. Kontrollera att CD8-låg-celler ingår i gating. Att sprida på CD3/CD8-positiva celler är ett kritiskt steg i det här protokollet.
Som aktivering av celler ofta leder till ner reglering av CD3 och / eller CD8, CD3 /CD8-låg celler bör också ingå. Efter detta rita DE CD8-positiva cellerna kontra tetramer cellerna, gating på CD8-positiva/tetramer-positiva celler. Spela om möjligt in 20, 000 celler i cd3-positiva och CD8-positiva grinden för varje prov.
Spara slutligen måtten som en FCS-fil. I detta protokoll upptäcktes kvantitativt antigenspecifika CD8+T-celler i blod- och vävnadsprover. Efter gating de CD3-positiva och CD8-positiva cellerna identifierades tetramer-positiva celler.
Två olika tetramers kombinerades i samma rör för färgning, vilket möjliggör samtidig kvantifiering av två olika CTL-särdrag. Med hjälp av detta protokoll kan T-cellssvar från samma mus följas över tid, eftersom endast små mängder blod behövs för varje mätning. Dessutom kan fenotyper av antigenspecifika CT:er analyseras.
Samtidigt som man försöker detta förfarande, Det är viktigt att undvika långvarig inkubationstider, eftersom detta kan leda till internalisering av T-cellsreceptorer. Sedan upptäckten av tetramerteknik har tetramerfärgning blivit ett viktigt verktyg för T-cellsanalys, och ett brett spektrum av tillämpningar, som inkluderar tetramers som tillkommer. En ljus framtid för ljusa tetramers.
