Bu yöntem, T-hücre immünolojisi ve viral vektör aşılarının geliştirilmesi alanındaki anahtar soruların cevapsız ına yardımcı olabilir. Bu yöntemin en büyük avantajı, aynı fareden tekrarlanan ölçümler sağlayan sadece az miktarda kana ihtiyaç duyulmasıdır. Ayrıca, virüs ve transgene özgü CTLs aynı örnekten tespit edilebilir.
Prosedürü gösteren Jasmine Rinnofner, bir teknisyen ve Annika Rossler, yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Numunelerin ölçülmesi ve analiz edilmesi, doktora sonrası Zoltan Banki olacaktır. Başlamak için, metin protokolüne göre fareyi güvenli bir şekilde dizginleyin.
Bir farenin kuyruk damarından EDTA kaplı bir tüpte 20 mikrolitre kan toplayın. Splenositler ile çalışırken, dalak izole ve bir hücre süzgeci ile doku basın için bir şırınga piston kullanın. Eritrositler üzerinde lysis yaptıktan sonra hücreleri sayın ve numunenin konsantrasyonu ayarla.
Her örnek için bir Facs tüpü hazırlayın ve etiketlendirin ve 100 mikrolitre organ süspansiyonu veya 20 mikrolitre kanı tüpe aktarın. Splenositler ile çalışırken, beş dakika boyunca organ süspansiyon santrifüj ve supernatant atın. Sonra, hücre pelet yeniden askıya almak için tüp girdap.
Kullanılacak her kanal için, bir telafi örneği için bir Facs tüpü de hazırlayın. Lekesiz kontrol olarak bir ek örnek hazırlayın. En uygun seyreltmelerde tetramerile Facs tamponları ve karıştırmak için girdap içeren bir tüp hazırlayın.
Daha sonra, her numuneye tetramer seyreltme 50 mikrolitre ve karıştırmak için girdap ekleyin. Telafi kontrollerine ve lekesiz örneğe tetramer olmadan Facs arabelleği ekleyin. Daha sonra, örnekleri karanlık koşullarda 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Örnekler kuluçkaya yatarken, bir tüpe Facs tamponu ekleyin. Daha sonra, metin protokolünün Tablo 2'sinde belirtilen seyreltmelere göre antikorları tampona ekleyin ve çözeltiyi girdap. Bilimsel soru bekleyen marker kombinasyonları, burada açıklanan dışında, kullanılabilir.
Panele CD3 ve CD8'e karşı her zaman antikor lar eklediğinden emin olun. Her kanal için, Facs tampon 200 mikrolitre ile bir tüp hazırlamak ve kendi renk CD8 karşı bir antikor seyreltme bir mikrolitre ekleyin ve girdap karıştırmak için. Daha sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi antikor seyreltmeleri saklayın.
Örnekleri yıkamak için, örneklere bir mililitre Facs tamponu ekleyin ve santrifüj edin. Sonra, supernatant atın ve kağıt havlu ile kalan sıvı drenaj. Kanla çalışırken, kalan sıvıyı boşaltırken dikkatli olun.
Eritrositlerin lysis önce, kan tüpün altına sopa olmaz. Alternatif olarak, supernatant aspire edebilirsiniz. Daha sonra, her hücre pelet ine 50 mikrolitre antikor çözeltisi ekleyin ve yavaşça girdap.
Karşılık gelen kompanzasyon kontrolüne her bir kompanzasyon karışımının 50 mikrolitresini ve lekesiz kontrolün hücre peletine 50 mikrolitre Facs tamponu ekleyin ve girdap yavaşça. Splenositlerle çalışırken, antikor boyamadan sonra numuneleri doğrudan bir ila iki mililitre Facs tamponu ve santrifüj ile beş dakika yıkayın. Sonra, supernatant atın ve kağıt havlu üzerinde kalan sıvı drenaj.
Her kan örneğine 500 mikrolitre ACK tamponu ekleyin ve yavaşça girdap. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika karanlıkta örnekleri kuluçkaya yatırın. Örneklere bir mililitre Facs tamponu ekleyin ve santrifüj ekleyin.
Sonra, supernatant atın ve kağıt havlu ile kalan sıvı drenaj. Eritrositlerin düzgün bir şekilde ölçülmesi Facs ölçümlerini kolaylaştırmak için çok önemli bir adımdır, bu nedenle pelet daha ıslak olduğunda eritrositlerin tekrar Örnekleri daha önce açıklandığı gibi tekrar yıkayın.
Sonra, supernatant atın ve bir kağıt havlu üzerinde kalan sıvı drenaj. Fiksasyon dan önce, kümeoluşumunu önlemek için hücrelerin iyice askıya alındıklarından emin olun. Her tüpe tampon sabitleme Facs 150 ila 300 mikrolitre ekleyin ve karıştırmak için girdap.
Ardından, akış sitometrik ölçümü ne kadar hızlı bir şekilde devam edin. İlk olarak, telafi kontrollerini ölçün ve herhangi bir spektral çakışmalar için doğru. Daha sonra, CD3-pozitif ve CD8-pozitif hücreler için seçmek için sıralı kapılar ayarlayın.
İleri ve yan saçılma alanını kullanarak lenfositler üzerinde kapı. Daha sonra, lenfosit popülasyon içinde, alan karşı ileri dağılım genişliği kullanarak tek hücrelerüzerinde kapı. Tek hücreli lenfositleri çizmek için CD3 ve CD8 kanallarını kullanın.
CD3-pozitif ve CD8-pozitif hücrelere gating ederek CD8-pozitif T-hücrelerini tanımlayın. CD8-düşük hücrelerin gating dahil olduğundan emin olun. CD3/CD8-pozitif hücrelerde yayılmabu protokolde kritik bir adımdır.
Hücrelerin aktivasyonu genellikle CD3 ve/veya CD8'in aşağı düzenlenmesine yol açtığından, CD3/CD8-düşük hücreler de eklenmelidir. Bundan sonra, CD8-pozitif/tetramer pozitif hücrelerüzerinde gating, tetramer hücreleri karşı CD8-pozitif hücreleri çizin. Mümkünse, her örnek için CD3-pozitif ve CD8-pozitif kapısına 20.000 hücre kaydedin.
Son olarak, ölçümleri FCS dosyası olarak kaydedin. Bu protokolde kan ve doku örneklerinde antijene özgü CD8+T hücreleri kan ve doku örneklerinde kantitatif olarak saptırıldı. CD3-pozitif ve CD8-pozitif hücreler gating sonra, tetramer-pozitif hücreler tespit edildi.
İki farklı tetramer boyama için aynı tüpte birleştirilerek iki farklı CTL özgülünün aynı anda ölçülmesi olanak sağladı. Bu protokol kullanılarak, her ölçüm için sadece küçük miktarda kan gerektiğinden, aynı fareden gelen T-hücre yanıtları zaman içinde izlenebilir. Ayrıca, antijene özgü CTL'lerin fenotipleri analiz edilebilir.
Bu prosedürü çalışırken, bu T-hücre reseptörlerinin içselleşmesine yol açabilir gibi, uzun kuluçka süreleri önlemek için önemlidir. Tetramer teknolojisinin keşfinden bu yana, tetramer boyama T-hücre analizi için önemli bir araç haline gelmiştir ve tetramerlerin birikmesi de dahil olmak üzere geniş bir uygulama yelpazesi. Parlak tetramerler için parlak bir gelecek.
