Name: chromatin immunoprecipitation of murine brown adipose tissue
Uploaded: 2018-11-21T15:00:00
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Les étapes de gestion d’animaux du protocole ont été approuvés par animalier institutionnel de l’Université de Boston et d’utilisation Comité (IACUC).
1. jour 1 : Dissection et préparation des chauve-souris pour l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
<ol><li>Euthanasier la souris à l’aide d’une chambre de dioxyde de carbone (CO2) et réaliser la dissection immédiatement par la suite. Pulvériser la souris fourrure avec l’éthanol à 70 % avant l’i...

<ol>
	<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. , (2004).</li><li>Cardamone, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Retrograde+Signaling+in+Mammals+Is+Mediated+by+the+Transcriptional+Cofactor+GPS2+via+Direct+Mitochondria-to-Nucleus+Translocation.">Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation.</a> Molecular Cell. 69, (2018).</li><li>Emmett, M. 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Le protocole décrit ici représente un outil précieux pour l’exécution de puce de tissus murins, spécialement optimisés pour le tissu adipeux brun. Parmi les plus grands défis dans l’accomplissement de morceau de tissu se remet un nombre suffisant de cellules au cours de la préparation de l’échantillon. Tonte la chauve-souris à l’aide d’un mélangeur homogénéisateur de tissu couplé avec des billes en acier inoxydable au lieu d’un pilon de verre canonique significativement réduit le nombre des cel...

Alors que le tissu adipeux blanc (WAT) spécialisé dans le stockage de l’énergie, tissu adipeux brun (TAB) dissipe l’énergie sous forme de chaleur en raison de sa capacité à convertir les glucides et lipides en énergie thermique via mitochondriales découplantes1. En raison de cette fonction spécialisée, le dépôt de chauve-souris est nécessaire pour le maintien de la température du corps dans les conditions physiologiques et en réponse à l’exposition au froid. Tandis que les modifications de l’expression génique au cours de la différenciation de la chauve-souris et sur stress thermogène ont été intensivement étudiées in vivo et in vitro, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces changements ont surtout été disséqué en lignées cellulaires immortalisées et primaire pré-adipocytes, à l’exception de plusieurs études in vivo2,3,4,5.
Réglementation des programmes d’expression de gènes spécifiques par le biais de régulation transcriptionnelle est obtenue par changements coordonnés dans la chromatine structure via transcription divers facteurs et facteurs conjointement des actions. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une approche de la biologie moléculaire précieux pour enquêter sur le recrutement de ces facteurs à l’ADN et les modifications connexes dans le paysage de la chromatine par profilage. Les facteurs clés du succès des expériences de puce incluent optimisations des conditions de réticulation et la chromatine cisaillement cohérence tout au long des échantillons différents, disponibilité du matériel de départ adéquat et, surtout, la qualité des anticorps. Si la puce de tissus entiers, il est également important de tenir compte de l’hétérogénéité des échantillons et d’optimiser le protocole pour améliorer l’efficacité de l’isolement des noyaux, ce dernier étant une étape particulièrement sensible lorsque vous travaillez avec le tissu adipeux due à la teneur en lipides élevés. En fait, les techniques d’isolation moléculaire de dépôts adipeux ensemble sont compliquées par la présence de niveaux élevés de triglycérides, et les protocoles doivent être optimisés pour augmenter la quantité d’isolement de la chromatine. Enfin, lorsque le séquençage haut-débit est effectué après l’isolement de l’ADN-ChIP, la profondeur de séquençage est essentielle pour déterminer le nombre de pics qui sont détectés en toute confiance.
Ici, nous nous référons aux étalons de travail et des orientations générales pour les expériences de ChIP-seq recommandés par le consortium ENCODE et modENCODE6 pour les meilleures pratiques, et nous nous concentrons sur une description étape par étape d’un protocole optimisé pour ChIP-seq de BAT. Le protocole décrit permet une isolation efficace de la chromatine du tissu adipeux pour effectuer le séquençage du génome pour facteurs de liaison à l’ADN avec des pics bien définies ainsi que histone marques avec les signaux plus diffus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bullet Blender Tissue Homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Next Advence&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BBX24</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter</td>
			<td style="width:113px;">Next Advence&#160;</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor Sonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml Micro Tube TPX Plastic&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30010010-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Complete-Protease inhibitor</td>
			<td style="width:113px;">Roche&#160;</td>
			<td>11836145001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A Agarose Slurry&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">GPS2 antibody</td>
			<td style="width:113px;">In house</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Pol2 antibody&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C15100055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">h3K9me3 antibody</td>
			<td style="width:113px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">05-1242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Fast Syber Green Master Mix</td>
			<td style="width:113px;">Aplied Biosytem</td>
			<td style="width:119px;">4385612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">ViiA7</td>
			<td style="width:113px;">Aplied Biosytem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq ChIP Library Preparation Kit</td>
			<td style="width:113px;">Illumina&#160;</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">HiSeq 2000&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Illumina&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation of murine brown adipose tissue

Processus plus cellulaires sont réglementées par transcriptional modulation de programmes spécifiques de gènes. Cette modulation est obtenue par l’action combinée d’un large éventail de facteurs de transcription (TFs) et cofacteurs médiation activation de la transcription ou de répression par des changements dans la structure de la chromatine. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une approche de la biologie moléculaire utiles pour la cartographie des modifications d’histone et profilage des facteurs de transcription/cofacteurs liaison à l’ADN, permettant ainsi un aperçu des changements dynamiques nucléaires survenant au cours de différentes processus biologiques.
Afin d’étudier la régulation de la transcription dans le tissu adipeux, les échantillons provenant de cultures de cellules in vitro d’immortalisé ou lignées cellulaires primaires sont souvent favorisées lors d’essais de puce à cause de l’abondance de la matière première et réduit la variabilité biologique. Cependant, ces modèles représentent un instantané limité de l’état réel de la chromatine dans les organismes vivants. Ainsi, il y a un besoin crucial pour les protocoles optimisés effectuer la puce sur des échantillons de tissus adipeux dérivées de modèles animaux.
Nous décrivons ici un protocole pour ChIP-seq efficace des modifications d’histone tant des protéines non histones dans le tissu adipeux brun (TAB) isolé à partir d’une souris. Le protocole est optimisé pour l’étude Génome-large la localisation des protéines d’intérêt et les marqueurs épigénétiques dans la chauve-souris, qui est un tissu morphologiquement et physiologiquement distinct parmi les dépôts de graisse.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58682/58682fig1.jpg"> Figure 1 : validation de morceau de qPCR. Puce-qPCR analyse de représentant GPS2 cibler les gènes NDUFV1 (à gauche) et TOMM20 (à droite) dans la chauve-souris de souris WT et GPS2-AKO, montrant les variations relatives du niveau de la méthylation de l’H3K9 et la liaison GPS2 et Pol2. Les graphiques à barres représentent la moyenne de l’échantillon de 3 répé...

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Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Immunoprécipitation de la chromatine du murin tissu adipeux brun

Nous décrivons ici un protocole pour l’immunoprécipitation de la chromatine efficace (ChIP) suivi par séquençage haut-débit (ChIP-seq) du tissu adipeux brun (TAB) isolé à partir d’une souris. Ce protocole est convenable pour les cartographie des modifications d’histone et enquêter sur tout le génome de localisation des protéines non histones d’intérêt in vivo.

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Le compteur, il est utilisé pour effectuer le séquençage efficace ChIP des protéines ester et non-ester dans le tissu lipidique brun isolé de la souris. Le principal avantage de la technique est que le protocole a été optimisé pour une immunoprécipitation efficace du complexe associé à la chromatine à partir du tissu lipidique. Avant l’incision, vaporiser la souris euthanasiée de 70 % d’éthanol.Placez la souris avec son dos face vers le haut, puis faire une incision le long du cou. Ensuite, situé BAT directement sous la peau entre les épaules et soigneusement enlever la fine couche de graisse blanche. Relier chaque plaquette BAT en 10 millilitres de PBS contenant 1 % de formaldéhyde pendant 15 minutes à 150 rpm à température ambiante.Après 15 minutes, étancher la liaison croisée en ajoutant 2,5 glycines molaires à la BAT, ce qui entraîne une concentration finale de 125 millimolaires. Placez-le sur un shaker pendant cinq minutes, en tournant à 150 RPM à température ambiante. Par la suite, transférez le tampon BAT à 500 microlitres de tampon de lyse hypotonique et ajoutez deux perles d’acier inoxydable pour chaque tampon BAT.Ensuite, utilisez un homogénéisateur de tissu à base de perles pour déchiqueter le tissu. Commencez par cinq minutes à puissance maximale. Si nécessaire, prolonger le temps jusqu’à ce que le tissu soit homogénéisé et que les cellules individuelles soient séparées.Transférer l’échantillon dans un nouveau tube et une centrifugeuse à 4 degrés Celsius à 16 000 G pendant 10 minutes. Après 10 minutes, transférer le supernatant dans un nouveau tube et garder la pastille cellulaire sur la glace. Centrifugeuse le supernatant à 4 degrés Celsius à 16 000 G pendant 10 minutes pour éviter la perte de cellules flottantes.Ensuite, jetez le supernatant final et re-suspendre les deux granulés cellulaires ensemble dans 300 microlitres de tampon de lyse SDS avec inhibiteur une fois protéase. Incuber sur la glace pendant 10 minutes. Ensuite, soniquez les lysates pour générer des fragments d’ADN de 200 à 500 paires de base de long.Après la sonication, enlever les débris par centrifugation pendant 10 minutes à 16 000 G à quatre degrés Celsius. Pour effectuer l’immunoprécipitation, gardez 1% de la solution de chromatine de côté comme entrée chip et gardez les entrées pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, ajoutez l’anticorps ChIP à un millilitre de solution de chromatine et effectuez une immunoprécipitation parallèle avec l’IgG préimmunisé correspondant ou l’IgG normal de la même espèce.Alternativement, économisez un millilitre de solution de chromatine pour un contrôle sans anticorps. Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius avec rotation. Pour recueillir les complexes immunitaires, ajouter 50 microlitres de protéines A agarose 50% slurry aux complexes immunitaires et incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius avec rotation à 150 RPM.Après une heure, pelleter les perles par centrifugation pendant une minute à 1000 fois G à quatre degrés Celsius. Effectuez des lavages séquentiels des perles sur des colonnes de filtre centrifuge PVDF de 0,45 micromètre avec des tampons d’une rigueur croissante en transférant d’abord les perles dans les colonnes avec 500 microlitres de tampon de lavage à faible teneur en sel. Ensuite, pelleter les perles dans les colonnes pendant trois minutes à 2500 G.Jeter le flux à travers.Répétez le lavage avec un tampon de lavage à haute teneur en sel selon les procédures de lavage à faible teneur en sel. Ensuite, répétez les procédures avec du chlorure de lithium et enfin avec une fois TE. Une fois les lavages terminés, élitez les complexes immunitaires en ajoutant 300 microlitres de tampon d’élitution aux perles granulées dans les colonnes. Incubez-les à température ambiante pendant 30 minutes sur un shaker à 400 RPM.Par la suite, recueillir l’é elfe en tournant dans les colonnes pendant trois minutes à 2500 G dans un tube frais. Inverser les liens croisés en incubant l’é luth et les intrants recueillis à 65 degrés Celsius pendant la nuit. Pour récupérer l’ADN, ajouter 300 microlitres de phénol chloroforme IAA à l’é luth et les entrées à un rapport un pour un et vortex pendant 10 secondes.Ensuite, tournez à 21 000 G à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Gardez la pastille et jetez le surnatant. Lavez la pastille avec un millilitre d’éthanol froid à 70 %.Puis tournez vers le bas à 21.000 G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jeter le surnatant et sécher à l’air le granulé. Suspendre à nouveau la pastille dans 70 microlitres d’eau sans DNAse pour d’autres procédures.Voici un exemple de PCR ChIP Q utilisant bat isolé de wildtype ou GPS2-A souris KNOCKOUT. Étant donné que le GPS2 s’est révélé nécessaire pour l’expression de gènes mitochondriaux codés nucléaires dans différentes lignées cellulaires, le recrutement de GPS2 a été testé sur deux gènes mitochondriaux spécifiques codés par le nucléaire. NDUFV1 et TOMM20 chez BAT à partir de souris comme exemples d’un tissu fortement enrichi en mitochondries.L’occupation de promoteur de GPS2 a été comparée dans les souris de KO de GPS2-A et les compagnons sauvages de lettre de type. Une diminution prévue a été observée dans la liaison GPS2 sur les gènes cibles sélectifs dans le BAT à partir de souris KNOCKOUT GPS2-A. En utilisant le protocole décrit ici, une liaison accrue de l’ARN polymésase deux et la marque d’histone répressive, H3K9ME3, a été enregistrée dans le BAT à partir de souris KNOCKOUT GPS2-A par rapport à des compagnons lettre de type sauvage.Ces résultats confirment le recrutement du GPS2 sur certains gènes mitochondriaux encodés nucléaires et montrent que le GPS2 est nécessaire pour prévenir l’accumulation de H3K9ME3 et donc nécessaire pour le décrochage du pôle deux activité transcriptionnelle sur les promoteurs cibles. Le protocole décrit ici, même s’il est spécifiquement optimisé pour le tissu adipeux brun, représente un outil précieux pour effectuer le ChIP à partir d’autres tissus murins et humains. N’oubliez pas que travailler avec le phénochoforme peut être extrêmement dangereux.Par conséquent, il est extrêmement important de toujours fonctionner sous le capot de fumée tout en utilisant ce reagent.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Extractions séquentielles de sels pour l’analyse de la chromatine en vrac, lier des propriétés de la chromatine modification Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Recherche

Génétique

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analyse du promoteur du ligand c-KIT utilisant l&#39;immunoprécipitation de la chromatine

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) dans les lignes de cellules T de souris

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Génération d’immunoprécipitation de la chromatine Native séquençage des bibliothèques pour l’analyse de densité de nucléosomes

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des Modifications d’Histone de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

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Chromatin Immunoprecipitation Assay Utilisation de nucléases micrococciques dans les cellules de mammifères

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Découverte des cibles réglementaires de csgD dans le biofilm de Salmonella utilisant l'immunoprécipitation de chromatine et le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Cartographie à haute résolution des interactions protéine-ADN dans les neurones dérivés des cellules souches de souris à l’aide de l’immunoprécipitation-exonucléase chromatine (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

Isolement des noyaux de tissus adipeux pour applications génomiques unicellulaires

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...