Name: chromatin immunoprecipitation of murine brown adipose tissue
Uploaded: 2018-11-21T15:00:00
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La procedura di gestione degli animali del protocollo è stata approvata dalla Boston University istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC).
1. giorno 1: Dissezione e preparazione di pipistrello per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)
<ol><li>Eutanasia di topi utilizzando una camera di anidride carbonica (CO2) ed eseguire la dissezione immediatamente in seguito. Spruzzo del mouse pelliccia con etanolo al 70% prima incisione. Posizionare il mouse con la schiena rivo...

<ol>
	<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. , (2004).</li><li>Cardamone, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Retrograde+Signaling+in+Mammals+Is+Mediated+by+the+Transcriptional+Cofactor+GPS2+via+Direct+Mitochondria-to-Nucleus+Translocation.">Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation.</a> Molecular Cell. 69, (2018).</li><li>Emmett, M. 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Il protocollo descritto qui rappresenta un prezioso strumento per l'esecuzione di ChIP da tessuti murini, specificamente ottimizzati per tessuto adiposo marrone. Una delle maggiori sfide nell'esecuzione di ChIP da tessuto sta riprendendo un numero sufficiente di cellule durante la preparazione del campione. Taglio del blocco utilizzando un frullatore omogeneizzatore del tessuto accoppiato con perline in acciaio inox anziché un pestello di vetro canonico significativamente riduce il numero di cellule perdita a causa del ...

Mentre il tessuto adiposo bianco (WAT) è specializzato per accumulo di energia, il tessuto adiposo bruno (BAT) dissipa energia sotto forma di calore grazie alla sua capacità di convertire carboidrati e lipidi in energia termica tramite disgiungente mitocondriale1. A causa di questa funzione specializzata, il deposito BAT è necessario per il mantenimento della temperatura corporea in condizioni fisiologiche e in risposta all'esposizione fredda. Mentre i cambiamenti di espressione genica durante il differenziamento BAT e termogenico a stress sono stati studiati estesamente in vitro ed in vivo, i meccanismi molecolari alla base di questi cambiamenti sono stati principalmente dissecato in linee cellulari immortalizzate e primario pre-adipociti, con l'eccezione di diversi studi in vivo2,3,4,5.
Regolazione dei programmi di espressione genica specifica attraverso regolazione trascrizionale è ottenuta dai coordinati cambiamenti nella cromatina struttura tramite trascrizione vari fattori e co-fattori azioni. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un approccio di biologia molecolare prezioso per indagare il reclutamento di questi fattori per DNA e per profilare i cambiamenti collegati nel paesaggio della cromatina. Fattori chiave per il successo degli esperimenti di ChIP includono ottimizzazioni delle condizioni di reticolazione e cromatina tosatura uniformità tra i diversi campioni, disponibilità del materiale di partenza adeguato e, soprattutto, qualità degli anticorpi. Durante l'esecuzione di ChIP da tessuti tutta, è anche importante considerare la eterogeneità dei campioni e ottimizzare il protocollo per migliorare l'efficienza dell'isolamento di nuclei, con quest'ultimo essendo un passo particolarmente sensibile quando si lavora con il tessuto adiposo dovuto il contenuto di lipidi elevati. In realtà, tecniche di isolamento molecolare da depositi adiposi intero sono complicati dalla presenza di alti livelli di trigliceridi e protocolli devono essere ottimizzati per aumentare la quantità di isolamento della cromatina. Infine, quando sequenziamento ad alte prestazioni viene eseguita dopo l'isolamento di DNA-ChIP, la profondità di sequenziamento è fondamentale per determinare il numero di picchi che vengono rilevati con fiducia.
Qui, ci riferiamo agli standard di lavoro e linee guida generali per gli esperimenti di ChIP-seq consigliati da ENCODE e modENCODE consorzi6 per best practices, e ci concentriamo su una descrizione dettagliata di un protocollo ottimizzato per ChIP-seq da BAT. Il protocollo descritto permette di eseguire il sequenziamento del genoma per fattori DNA-binding con picchi ben definiti, nonché marchi di istone con segnali più diffusi per efficiente isolamento della cromatina dal tessuto adiposo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bullet Blender Tissue Homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Next Advence&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BBX24</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter</td>
			<td style="width:113px;">Next Advence&#160;</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor Sonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml Micro Tube TPX Plastic&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30010010-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Complete-Protease inhibitor</td>
			<td style="width:113px;">Roche&#160;</td>
			<td>11836145001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A Agarose Slurry&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">GPS2 antibody</td>
			<td style="width:113px;">In house</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Pol2 antibody&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C15100055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">h3K9me3 antibody</td>
			<td style="width:113px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">05-1242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Fast Syber Green Master Mix</td>
			<td style="width:113px;">Aplied Biosytem</td>
			<td style="width:119px;">4385612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">ViiA7</td>
			<td style="width:113px;">Aplied Biosytem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq ChIP Library Preparation Kit</td>
			<td style="width:113px;">Illumina&#160;</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">HiSeq 2000&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Illumina&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation of murine brown adipose tissue

Processi più cellulari sono regolati dalla modulazione trascrizionale dei programmi di gene specifico. Tale modulazione è raggiunto attraverso l'azione combinata di una vasta gamma di fattori di trascrizione (TFs) e cofattori che mediano l'attivazione trascrizionale o repressione attraverso cambiamenti nella struttura della cromatina. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un approccio di biologia molecolare utili per la mappatura modificazioni istoniche e profilatura di fattori di trascrizione/cofattori vincolante al DNA, fornendo così un'istantanea dei cambiamenti nucleari dinamiche che si verificano durante diversi processi biologici.
Per studiare la regolazione trascrizionale nel tessuto adiposo, campioni provenienti da colture di cellule in vitro di immortalato o linee cellulari primarie sono spesso favorite nelle analisi di ChIP per l'abbondanza di materiale di partenza e ridotta variabilità biologica. Tuttavia, questi modelli rappresentano un'istantanea limitata dello stato effettivo della cromatina negli organismi viventi. Così, c'è un bisogno fondamentale per protocolli ottimizzati eseguire ChIP su campioni di tessuto adiposo derivati da modelli animali.
Qui descriviamo un protocollo per efficiente ChIP-seq di modificazioni istoniche e di proteine non istoniche in tessuto adiposo marrone (pipistrello) isolato da un mouse. Il protocollo è ottimizzato per lo studio di genoma la localizzazione delle proteine di interesse e marcatori epigenetici nel pipistrello, che è un tessuto morfologicamente e fisiologicamente distinti tra i depositi di grasso.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58682/58682fig1.jpg"> Figura 1: convalida di ChIP di qPCR. Analisi di chIP-qPCR di rappresentante GPS2 geni NDUFV1 (a sinistra) e TOMM20 (a destra) dell'obiettivo nel pipistrello di topi WT e GPS2-AKO, mostrando variazioni relative del livello di metilazione di H3K9 e GPS2 e Pol2 vincolante. I grafici a barre rappresentano la media del campione di 3 replicati con * p < 0.05 e * * p < 0.01 calc...

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Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Immunoprecipitazione della cromatina del tessuto adiposo marrone murino

Qui descriviamo un protocollo per immunoprecipitazione efficiente della cromatina (ChIP) seguito da sequenziamento del DNA di alto-rendimento (ChIP-seq) del tessuto adiposo marrone (pipistrello) isolato da un mouse. Questo protocollo è adatto sia per mappatura modificazioni istoniche e indagando genoma localizzazione delle proteine non istoniche di interesse in vivo.

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Il misurato per cui viene utilizzato per eseguire un efficiente sequenziamento ChIP di proteine estere e non estere nel tessuto lipidico marrone isolato dal topo. Il principale vantaggio della tecnica è che il protocollo è stato ottimizzato per un'efficace immunoprecipitazione del complesso associato alla cromatina dal tessuto lipidico. Prima dell'incisione, spruzzare il topo eutanasiato con il 70% di etanolo.Posizionare il mouse con la schiena rivolta verso l'alto, quindi fare un'incisione lungo il collo. Successivamente, situato BAT direttamente sotto la pelle tra le spalle e rimuovere con cura il sottile strato di grasso bianco. Collegare rà mente ogni bat pad in 10 millilitri di PBS contenenti l'1% di formaldeide per 15 minuti a 150 giri/min a temperatura ambiente.Dopo 15 minuti, dissetare il cross-linking aggiungendo 2,5 glicina molare alla BAT, con una concentrazione finale di 125 millimolare. Posizionarlo su uno shaker per cinque minuti, ruotando a 150 giri/min a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire il bat pad a 500 microlitri di tampone di lisi ipotonica e aggiungere due perline in acciaio inossidabile per ogni bat pad.Quindi, utilizzare un omogeneizzatore di tessuti a base di perline per distruggere il tessuto. Inizia con cinque minuti alla massima potenza. Se necessario, prolungare il tempo fino a quando il tessuto non è omogeneizzato e le singole cellule sono separate.Trasferire il campione in un nuovo tubo e centrifugare a quattro gradi Celsius a 16.000 G per 10 minuti. Dopo 10 minuti, trasferire il supernatante in un nuovo tubo e mantenere il pellet cellulare sul ghiaccio. Centrifugare il supernatante a quattro gradi Celsius a 16.000 G per 10 minuti per prevenire la perdita di cellule galleggianti.Quindi, scartare il supernatante finale e sospendere di nuovo entrambi i pellet cellulari insieme in 300 microlitri di tampone di lisi SDS con un inibitore della proteasi una volta. Incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Successivamente, sonicare i lysati per generare frammenti di DNA lunghi da 200 a 500 coppie di basi.Dopo la sonicazione, rimuovere i detriti per centrifugazione per 10 minuti a 16.000 G a quattro gradi celsius. Per eseguire l'immunoprecipitazione, tenere da parte l'1% della soluzione di cromatina come ingresso ChIP e mantenere gli ingressi durante la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, aggiungere l'anticorpo ChIP a un millilitro di soluzione di cromatina ed eseguire l'immunoprecipitazione parallela con igG pre-immune corrispondente o IgG normale della stessa specie.In alternativa, salvare un millilitro di soluzione di cromatina per un controllo senza anticorpi. Incubare durante la notte a quattro gradi Celsius con rotazione. Per raccogliere i complessi immunitari, aggiungere 50 microlitri di proteina A agarosio 50% liquami ai complessi immunitari e incubare per un'ora a quattro gradi Celsius con rotazione a 150 RPM.Dopo un'ora, pellet le perline per centrifugazione per un minuto a 1000 volte G a quattro gradi Celsius. Eseguire lavaggi sequenziali delle perline su colonne filtranti centrifughe PVDF da 0,45 micrometri con buffer di crescente rigore trasferendo prima le perline nelle colonne con 500 microlitri di tampone di lavaggio a basso contenuto di sale. Quindi, pelletare le perline nelle colonne per tre minuti a 2500 G.Scartare il flusso.through.Ripetere il lavaggio con un alto tampone di lavaggio del sale secondo le procedure di lavaggio a basso contenuto di sale. Quindi, ripetere le procedure con cloruro di litio e infine con one times TE. Una volta completati i lavaggi, eludere i complessi immunitari aggiungendo 300 microlitri di tampone di eluizione alle perline pelletate nelle colonne. Incubarli a temperatura ambiente per 30 minuti su uno shaker a 400 giri/min.Successivamente, raccogliere l'elute facendo girare le colonne per tre minuti a 2500 G in un tubo fresco. Invertire i collegamenti incrociati incubando l'eluto e gli input raccolti a 65 gradi Celsius durante la notte. Per recuperare il DNA, aggiungere 300 microlitri di fenolo cloroformio AIA all'eluto e ingressi con un rapporto uno-a-uno e vortice per 10 secondi.Quindi, spin down a 21.000 G a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Conservare il pellet e scartare il supernatante. Lavare il pellet con un millilitro di 70% di etanolo freddo.Quindi gira verso il basso a 21.000 G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e asciugare all'aria il pellet. Sospendere di nuovo il pellet in 70 microlitri di acqua priva di DNAsi per ulteriori procedure.Ecco un esempio di CHIP Q PCR che utilizza BAT isolato da topi knockout GPS2-A. Poiché il GPS2 è stato trovato necessario per l'espressione di geni mitocondriali codificati nucleari in diverse linee cellulari, il reclutamento di GPS2 è stato testato su due specifici geni mitocondriali codificati nucleare. NDUFV1 e TOMM20 in BAT da topi come esempi di un tessuto altamente arricchito nei mitocondri.L'occupazione del promotore GPS2 è stata confrontata nei topi knockout GPS2-A e nei compagni di lettera di tipo selvaggio. Una diminuzione prevista è stata osservata nel legame GPS2 sui geni bersaglio selettivi nella BAT da topi knockout GPS2-A. Utilizzando il protocollo qui descritto, un aumento del legame dell'RNA polimerasi due e il segno istono repressivo, H3K9ME3, è stato registrato nella BAT da topi knockout GPS2-A rispetto ai compagni di lettera di tipo selvaggio.Questi risultati confermano il reclutamento di GPS2 su determinati geni mitocondriali codificati nucleari e mostrano che gps2 è necessario per prevenire l'accumulo di H3K9ME3 e quindi necessario per lo stallo dell'attività trascrizionale del polo due sui promotori bersaglio. Il protocollo qui descritto, anche se specificamente ottimizzato per il tessuto adiposo marrone, rappresenta uno strumento prezioso per eseguire il ChIP da altri tessuti murini e umani. Non dimenticare che lavorare con il fenocloroforme può essere estremamente pericoloso.Pertanto, è estremamente importante operare sempre sotto la cappa dei fumi durante l'utilizzo di questo reagente.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Estrazioni sequenziale sale per l'analisi di massa di cromatina associazione proprietà di complessi di rimodellamento della cromatina

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Ricerca

Genetica

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Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

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Immunoprecipitazione cromatinica (ChIP) nelle linee di cellule T delle cellule

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Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di modificazioni istoniche da Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

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Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Individuazione degli obiettivi normativi CsgD nel biofilm della Salmonella mediante l'immunoprecipitazioni della cromatina e il sequenziamento ad alto rendimento (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Mappatura ad alta risoluzione delle interazioni proteina-DNA nei neuroni derivati dalle cellule staminali del topo utilizzando l'immunoprecipitazione-esonucleasi della cromatina (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

Isolamento dei nuclei di tessuti adiposi per applicazioni genomiche a singola cellula

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...