Name: chromatin immunoprecipitation of murine brown adipose tissue
Uploaded: 2018-11-21T15:00:00
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프로토콜의 동물 처리 단계는 보스턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다.
1. 주 1: 해 부와 Chromatin Immunoprecipitation (칩)에 대 한 박쥐의 준비
<ol><li>이산화탄소 (CO2) 챔버를 사용 하 여 마우스를 안락사 하 고 해 부를 즉시 수행 이후에. 절 개 전에 70% 에탄올 스프레이 마우스 모피. 다음 자르면 목 따라 피부는 다시 위로 향하도록 마우스...

<ol>
	<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. , (2004).</li><li>Cardamone, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Retrograde+Signaling+in+Mammals+Is+Mediated+by+the+Transcriptional+Cofactor+GPS2+via+Direct+Mitochondria-to-Nucleus+Translocation.">Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation.</a> Molecular Cell. 69, (2018).</li><li>Emmett, M. 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여기에 설명 된 프로토콜 murine 조직, 갈색 지방 조직 최적화에서 칩을 수행 하기 위한 유용한 도구를 나타냅니다. 조직에서 수행 하는 칩에 큰 과제 중 하나는 샘플 준비 하는 동안 세포의 충분 한 수를 회복 됩니다. 박쥐는 정식 유리 유 봉 대신 스테인리스 구슬 크게 결합 조직 균질 화기 믹서 기를 사용 하 여 전단 파손 되지 않는 조직으로 인해 손실 된 세포의 수를 줄입니다. 또한, 소형 버퍼에?...

반면 흰색 adipose 조직 (WAT)는 에너지 저장을 위해 전문화 된다, 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐) 열 에너지를 통해 미토 콘 드리 아 연결을 푸는1탄수화물과 지질을 변환 하는 기능으로 인해 열 형태로 에너지 없어져 요. 이 특수 기능 때문에 박쥐 디포는 생리 적 조건에 찬 노출에 대 한 응답에 체온의 유지 보수를 위해 필요 합니다. 진 식 변화와 박쥐 차별화 동안 thermogenic 스트레스에 따라 vivo에서 그리고 생체 외에서 광범위 하 게 공부 되었다, 그러나 분자 메커니즘 기본이 변경 되었습니다 주로 불멸 하 게 세포에 해 부와 기본 vivo에서 몇몇 예외 사전 adipocytes,2,3,,45를 공부 한다.
Transcriptional 규칙을 통해 특정 유전자 식 프로그램의 조정된 변화 chromatin 구조를 통해 다양 한 녹음 방송 요인 및 공동 작업 요인에 의해 이루어집니다. Chromatin immunoprecipitation (칩)은 DNA 이러한 요소의 채용 조사 및 프로 파일링 chromatin 풍경에 관련 된 변화에 대 한 귀중 한 분자 생물학 접근 이다. 칩 실험의 성공에 대 한 핵심 요인 가교 조건 및 적절 한 시작 물자 및, 특히, 항 체의 품질의 다른 예제를 통해 chromatin 전단 일관성의 최적화를 포함합니다. 전체 조직에서 칩을 수행할 때 그것은 또한 중요 한 고려 하는 샘플의이 고 핵 격리의 효율성을 개선 하기 위해 프로토콜 최적화, 후자와 되 고 특히 민감한 단계 때문에 지방 조직에서 작업할 때 상승 된 지질 내용입니다. 사실, 전체 지방 창 고에서 분자 격리 기술을 높은 수준의 트리 글리세라이드의 존재에 의해 복잡은 고 chromatin 격리의 양을 증가 시키는 프로토콜을 최적화 해야 합니다. 마지막으로, 높은 처리량 시퀀싱 칩-DNA 분리 후 수행 될 때 시퀀싱 깊이 봉우리는 자신 있게 검색의 수를 결정 하기 위한 중요 합니다.
여기, 우리 작업 표준 및 인코딩 및 modENCODE 컨소시엄6 모범 사례에 대 한 권장 하는 칩 seq 실험에 대 한 일반적인 지침을 참조 하 고 우리는 칩 seq 박쥐에서 최적화 된 프로토콜에 대 한 단계별 설명에 초점. 설명된 프로토콜 chromatin 지방 조직에서의 효율적인 절연에 대 한 더 확산 신호와 히스톤 부호 뿐만 아니라 잘 정의 된 봉우리 DNA 바인딩 요소에 대 한 게놈 넓은 시퀀싱을 수행 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bullet Blender Tissue Homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Next Advence&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BBX24</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter</td>
			<td style="width:113px;">Next Advence&#160;</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor Sonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml Micro Tube TPX Plastic&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30010010-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Complete-Protease inhibitor</td>
			<td style="width:113px;">Roche&#160;</td>
			<td>11836145001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A Agarose Slurry&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">GPS2 antibody</td>
			<td style="width:113px;">In house</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Pol2 antibody&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C15100055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">h3K9me3 antibody</td>
			<td style="width:113px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">05-1242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Fast Syber Green Master Mix</td>
			<td style="width:113px;">Aplied Biosytem</td>
			<td style="width:119px;">4385612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">ViiA7</td>
			<td style="width:113px;">Aplied Biosytem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq ChIP Library Preparation Kit</td>
			<td style="width:113px;">Illumina&#160;</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">HiSeq 2000&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Illumina&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation of murine brown adipose tissue

대부분 세포 프로세스는 특정 유전자 프로그램의 transcriptional 변조에 의해 통제 된다. 이러한 변조 다양 한 녹음 방송 요인 (TFs) 및 공동 인자 중재 transcriptional 활성화 또는 염색 질 구조에 변화를 통해 억압의 결합 된 행동을 통해 이루어집니다. Chromatin immunoprecipitation (칩)은 히스톤 수정 매핑 및 다른 하는 동안 발생 하는 동적 핵 변화의 스냅숏으로 제공 녹음 방송 요인/공동 인자 dna 바인딩 프로 파일링을 위한 유용한 분자 생물학 접근 생물 학적 프로세스입니다.
공부 하 고 지방 조직에 transcriptional 규칙, 체 외에서 세포 배양의에서 파생 된 샘플 불후 또는 1 차 셀 라인 시작 물자의 풍부 때문에 칩 분석 실험에 종종 선호 하 고 생물 다양성을 감소. 그러나, 이러한 모델 생명체에서 실제 chromatin 상태의 제한 된 스냅숏을 나타냅니다. 따라서, 동물 모델에서 파생 된 지방 조직 샘플에 칩을 수행 하기 위해 최적화 된 프로토콜에 대 한 중요 한 필요는.
여기 우리는 히스톤 수정 및 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 고립에 있는 비 히스톤 단백질의 효율적인 칩 seq에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜의 관심과 지방 저장소 사이 형태학 상으로 그리고 생리 적으로 뚜렷한 조직 박쥐에 epigenetic 마커 단백질의 게놈 넓은 지역화를 조사 하 고 최적화 되어 있습니다.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58682/58682fig1.jpg"> 그림 1: 정량 하 여 유효성 검사를 칩. 대표 GPS2의 칩 정량 분석 대상으로 H3K9 메 틸 화 및 GPS2 및 Pol2 바인딩 수준에서 상대적 변화를 보여주는 WT 및 GPS2-아카 호 쥐의 박쥐에 유전자 NDUFV1 (왼쪽)와 TOMM20 (오른쪽). 막대 그래프와 함께 3 복제의 표본 평균이 대표 * p < 0.05와 * * p < 0.01 계산 ?...

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Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

여기는 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 분리의 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq) 다음 효율적인 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 히스톤 수정 매핑와 관심 비보의 비 히스톤 단백질의 게놈 넓은 지역화 조사에 적합 합니다.

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

마우스로부터 분리된 갈색 지질 조직에서 에스테르 와 비 에스테르 단백질의 효율적인 ChIP 시퀀싱을 수행하는 데 사용되는 미터. 이 기술의 주요 장점은 프로토콜이 지질 조직에서 크로마틴 관련 복합체의 효율적인 면역 침전을 위해 최적화되었다는 것입니다. 절개하기 전에 안락사 마우스를 70 %에탄올로 스프레이하십시오.마우스를 등을 위로 향하게 한 다음 목을 따라 절개를 합니다. 다음으로, 어깨 사이의 피부 바로 아래에 BAT를 배치하고 조심스럽게 백색 지방의 얇은 층을 제거합니다. 각 BAT 패드를 실온에서 150 RPM에서 15분 동안 1%포름알데히드를 함유한 PBS 10 밀리리터로 교차 연결합니다.15분 후 BAT에 2.5 개의 어어 글리신을 추가하여 교차 연결을 담금질하여 125 밀리머의 최종 농도를 생성합니다. 실온에서 150 RPM에서 회전, 5 분 동안 셰이커에 배치합니다. 그 후 BAT 패드를 저혈압 용해 버퍼 500 마이크로리터로 옮기고 각 BAT 패드에 두 개의 스테인레스 스틸 구슬을 추가합니다.그런 다음, 비드 계 조직 균질화제를 사용하여 조직을 분쇄한다. 최대 전력에서 5분으로 시작합니다. 필요한 경우 조직이 균질화되고 단일 세포가 분리 될 때까지 시간을 연장하십시오.샘플을 새로운 튜브로 옮기고 원심분리기는 16도, 000 G에서 10분 동안 섭씨 4도에서 전달합니다. 10분 후, 상체관을 새로운 튜브로 옮기고 세포 펠릿을 얼음 위에 보관합니다. 16, 000 G에서 섭씨 4도에서 상피분리하여 부동 세포의 손실을 방지합니다.그런 다음 최종 상체를 버리고 SDS 용해 버퍼의 300 마이크로 리터에서 두 세포 펠릿을 1 회 프로테아제 억제제로 다시 중단하십시오. 10분 동안 얼음에 배양하세요. 다음으로, 리세이츠를 초음파 처리하여 DNA 단편을 200 내지 500개의 기본 쌍을 길게 생성한다.초음파 처리 후, 섭씨 4도에서 16, 000G에서 10 분 동안 원심 분리하여 파편을 제거하십시오. 면역 침전을 수행하기 위해 ChIP 입력으로 크로마틴 용액의 1 %를 제쳐두고 밤새 입력을 섭씨 4도에서 유지하십시오. 다음으로, ChIP 항체를 크롬틴 용액의 1밀리리터에 추가하고 동일한 종의 해당 전면역 IgG 또는 정상 IgG와 병행 면역 침전을 수행한다.또는 항체 제어가 없는 크로마틴 용액 1밀리리터를 저장하십시오. 회전과 섭씨 4도에서 하룻밤 을 배양. 면역 복합체를 수집하려면 면역 복합체에 50 마이크로리터를 넣고 150 RPM에서 회전하여 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다.한 시간 후, 4섭씨에서 1000배 G에서 1분간 원심분리로 구슬을 살포합니다. 0.45 마이크로미터 PVDF 원심 필터 컬럼에서 구슬의 순차적 세척을 수행하여 500 마이크로리터의 낮은 염분 세척 버퍼로 컬럼의 구슬을 먼저 이송하여 스트링성이 증가하는 버퍼를 수행합니다. 그런 다음 2500 G.에서 3분 동안 기둥에 있는 구슬을 플로우스루를 버립니다.낮은 소금 세척 절차에 따라 높은 소금 세척 버퍼로 세척을 반복합니다. 그런 다음 염화물 리튬으로 절차를 반복하고 마지막으로 1 회 TE로 절차를 반복하십시오. 세치가 완료된 후, 기둥의 펠렛 구슬에 용출 완충제 300 마이크로리터를 추가하여 면역 복합체를 엘테한다. 400 RPM의 셰이커에서 실온에서 30분 동안 배양하십시오.그 후, 신선한 튜브에서 2500 G에서 3 분 동안 열을 회전하여 엘루트를 수집합니다. 하룻밤 사이에 65도에서 수집된 엘루트와 입력을 배양하여 교차 링크를 반전시면 됩니다. DNA를 복구하려면 페놀 클로로폼 IAA 300마이크로리터를 1대1 비율로 엘ute 및 입력에 10초 간 첨가합니다.다음으로 섭씨 4도에서 21, 000 G에서 20분간 회전합니다. 펠릿을 보관하고 상체를 폐기하십시오. 차가운 70%에탄올 1밀리리터로 펠릿을 씻으십시오.그런 다음 섭씨 4도에서 21, 000 G에서 5 분간 회전합니다. 상체를 버리고 펠릿을 건조시키십시오. 추가 절차를 위해 DNAse가없는 물의 70 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.다음은 야생형 또는 GPS2-A 녹아웃 마우스로부터 분리된 BAT를 이용한 ChIP Q PCR의 예입니다. GPS2는 상이한 세포주에서 핵 인코딩된 미토콘드리아 유전자의 발현에 필요한 것으로 밝혀졌기 때문에 GPS2의 모집은 두 개의 특정 핵 인코딩 된 미토콘드리아 유전자에 대해 테스트되었다. 미토콘드리아에서 고도로 농축된 조직의 예로 마우스로부터 BAT에서 NDUFV1 및 TOMM20.GPS2 프로모터 점유율은 GPS2-A 녹아웃 마우스와 야생 형 문자 메이트에서 비교되었다. GPS2-A 녹아웃 마우스로부터 BAT의 선택적 표적 유전자에 대한 GPS2 결합에서 예상되는 감소가 관찰되었다. 여기에 기재된 프로토콜을 이용하여, RNA 폴리머라제 2개 및 억압히스톤 마크인 H3K9ME3의 증가된 결합은 GPS2-A 녹아웃 마우스로부터 의 박쥐에 기록되었다.이러한 결과는 선택된 핵인코딩된 미토콘드리아 유전자에 대한 GPS2모집을 확인하고, GPS2가 H3K9ME3의 축적을 막기 위해 요구되고 따라서 표적 프로모터에 대한 극 2전사 활동의 실속에 요구된다는 것을 보여준다. 여기에 설명된 프로토콜은 갈색 지방 조직에 특별히 최적화되어 있더라도 다른 뮤린 및 인간 조직에서 ChIP를 수행하기 위한 소중한 도구를 나타냅니다. 페노클로로폼을 사용하면 매우 위험할 수 있습니다.따라서 이 시약을 사용하는 동안 항상 연기 후드 아래에서 작동하는 것이 매우 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

연구

유전학

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin Immunoprecipitation을 이용한 c-KIT 리간드 프로모터 분석

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

히스톤 수정 Saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin Immunoprecipitation (칩)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

크로마틴 면역침전 및 고처리량 시퀀싱(ChIP-seq)을 이용한 살모넬라 바이오필름의 CsgD 규제 목표 발견

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

단세포 게놈 응용을 위한 지방 조직 핵의 격리

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...