Name: chromatin immunoprecipitation of murine brown adipose tissue
Uploaded: 2018-11-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue at JoVE.com

Hayvan işleme adımları Protokolü'nün Boston Üniversitesi'nin kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış olması.
1. gün 1: Diseksiyon ve kromatin Immunoprecipitation (ChIP) BAT hazırlanması
<ol><li>Karbondioksit (CO2) odası kullanarak fare ötenazi ve diseksiyon gerçekleştirdikten hemen sonra. Fare kürk kesi önce % 70 etanol ile sprey. Fare, karşı karşıya sırt o zaman boyunca boyun deri kesip yerleştirin. Deri omuz arasında d...

<ol>
	<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. , (2004).</li><li>Cardamone, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Retrograde+Signaling+in+Mammals+Is+Mediated+by+the+Transcriptional+Cofactor+GPS2+via+Direct+Mitochondria-to-Nucleus+Translocation.">Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation.</a> Molecular Cell. 69, (2018).</li><li>Emmett, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+3+prepares+brown+adipose+tissue+for+acute+thermogenic+challenge.">Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge.</a> Nature. , (2017).</li><li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRDM16+binds+MED1+and+controls+chromatin+architecture+to+determine+a+brown+fat+transcriptional+program.">PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program.</a> Genes &amp; Development. , (2015).</li><li>Shapira, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EBF2+transcriptionally+regulates+brown+adipogenesis+via+the+histone+reader+DPF3+and+the+BAF+chromatin+remodeling+complex.">EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex.</a> Genes &amp; Development. , (2017).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).</li><li>Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Stromal+Vascular+Cells+to+Beige/Brite+Cells.">Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).</li><li>. Genome Browser Gateway Available from: <a target="_blank" href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10</a> (2018)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. , 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+alignment/map+(SAM)+format+and+SAMtools.">The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins.">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).</li><li>Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+artifact+removal+on+ChIP+quality+metrics+in+ChIP-seq+and+ChIP-exo+data.">Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data.</a> Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).</li><li>Ram&#237;rez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools2:+A+next+Generation+Web+Server+for+Deep-Sequencing+Data+Analysis.">deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis.</a> Nucleic Acids Research. , (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, R137 (2008).</li><li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li><li>Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reproducibility+of+high-throughput+experiments.">Measuring reproducibility of high-throughput experiments.</a> Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).</li><li>. Irreproducible Discovery Rate (IDR) Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nboley/idr">https://github.com/nboley/idr</a> (2018)</li><li>The Gene Ontology Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+Gene+Ontology+Knowledgebase+and+Resources.">Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources.</a> Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.">Gene Ontology: tool for the unification of biology.</a> Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).</li><li>Boeva, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Genomic+Sequence+Motifs+for+Deciphering+Transcription+Factor+Binding+and+Transcriptional+Regulation+in+Eukaryotic+Cells.">Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells.</a> Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).</li></ol>

Burada açıklanan protokolü üzerinden fare dokular, özellikle kahverengi yağ dokusu için en iyi duruma getirilmiş ChIP yerine getirmek için değerli bir araç temsil eder. Hücreleri yeterli sayıda numune hazırlama sırasında yapılan çip dokudan işlemlerinde büyük zorluklardan biri kurtarıyor. SOPAYI önemli ölçüde paslanmaz çelik boncuk yerine bir kanonik cam havaneli ile birleştiğinde bir doku homogenizer blender kullanarak kesme kırılmamış doku nedeniyle kayıp hücre sayısını azaltır. A...

Beyaz Yağ dokusundan (WAT) enerji depolama için uzman iken, kahverengi yağ dokusundan (BAT) karbonhidratlar ve yağlar termal enerji ile mitokondrial uncoupling1dönüştürmek için onun yetenek nedeniyle ısı formunda enerji kalır. Bu özel işlevi nedeniyle yarasa Depo bakımı vücut ısısı fizyolojik koşullarda ve yanıt-e doğru soğuk pozlama için gereklidir. Gen ifade değişiklikleri sırasında yarasa farklılaşma ve termojenik stres üzerine kapsamlı bir şekilde içinde vivo ve tüp bebek incelenmiştir, bu değişiklikler temel moleküler mekanizmaları çoğunlukla disseke ölümsüzleştirdi hücre hatlarında ve birincil edilmiş öncesi adipositler, birkaç içinde vivo çalışmalar2,3,4,5dışında.
Düzenleme, belirli bir gen ifade transkripsiyon düzenleme programlarını koordine değişiklikleri çeşitli transkripsiyon faktörleri ve ortak eylemler faktörler kromatin yapısı ile elde edilir. Kromatin immunoprecipitation (ChIP), işe alım için DNA bu faktörlerin araştırılması ve kromatin manzara ilişkili değişimler profil oluşturma için bir değerli moleküler biyoloji yaklaşımdır. ChIP deneyler başarısı için önemli faktörler crosslinking koşullar ve farklı örnekleri, boyunca kromatin kesme tutarlılık yeterli Başlangıç materyali ve en önemlisi, antikorlar kalitesini en iyi duruma getirmeleri içerir. ChIP bütün dokulardan gerçekleştirirken, heterojen örnekleri göz önünde bulundurun ve çekirdekleri yalıtım verimliliğini artırmak için iletişim kuralı en iyi duruma getirmek önemlidir, ikincisi ile özellikle hassas bir adım olması nedeniyle yağ dokusu ile çalışırken yükseltilmiş lipid içerik. Aslında, tüm yağ depoları moleküler yalıtım teknikleri trigliserid düzeyi yüksek varlığı ile karmaşık ve protokolleri kromatin yalıtım miktarını artırmak için optimize edilmiş olması gerekir. Yüksek işlem hacmi sıralama sonra ChIP-DNA izolasyon gerçekleştirildiğinde, son olarak, sıralama derinlik güvenle algılanır doruklarına sayısını belirlemek için önemlidir.
Burada, biz çalışma standartları ve kodla ve modENCODE konsorsiyumlar6 için en iyi yöntemler tarafından önerilen ChIP-seq deneyler için genel kurallar bakın ve ChIP-seq yarasa üzerinden için optimize edilmiş bir protokol, adım adım açıklamasını odaklanmak. DNA'ya bağlanıcı faktörler iyi tanımlanmış zirveleri ile hem de histon işaretleri kapatıyor sinyalleri ile genom çapındaki sıralama gerçekleştirmek için açıklanan protokol kromatin Yağ dokusundan verimli izolasyon sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:637px;" width="638">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bullet Blender Tissue Homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Next Advence&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BBX24</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter</td>
			<td style="width:113px;">Next Advence&#160;</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioruptor Sonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml Micro Tube TPX Plastic&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30010010-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Complete-Protease inhibitor</td>
			<td style="width:113px;">Roche&#160;</td>
			<td>11836145001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A Agarose Slurry&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">GPS2 antibody</td>
			<td style="width:113px;">In house</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Pol2 antibody&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C15100055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">h3K9me3 antibody</td>
			<td style="width:113px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">05-1242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Fast Syber Green Master Mix</td>
			<td style="width:113px;">Aplied Biosytem</td>
			<td style="width:119px;">4385612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">ViiA7</td>
			<td style="width:113px;">Aplied Biosytem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq ChIP Library Preparation Kit</td>
			<td style="width:113px;">Illumina&#160;</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">HiSeq 2000&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Illumina&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation of murine brown adipose tissue

En hücresel belirli bir gen programları transkripsiyon modülasyon tarafından düzenlenmektedir. Böyle modülasyon transkripsiyon faktörleri (TFs) ve transkripsiyon harekete geçirmek ya da baskı yoluyla kromatin yapısı değişimler arabuluculuk Kofaktörler geniş bir Birleşik eylemler yoluyla elde edilir. Histon değişiklikler eşleme ve transkripsiyon faktörleri/Kofaktörler DNA için bağlama profil oluşturma, böylece bir anlık görüntüsünü farklı sırasında meydana gelen dinamik nükleer değişiklikleri sağlamak için yararlı moleküler biyoloji yaklaşım kromatin immunoprecipitation (ChIP) olduğunu biyolojik süreçleri.
Yağ dokusu transkripsiyon Yönetmelikte çalışmaya, vitro hücre kültürleri türetilmiş örnekleri ölümsüzleştirilmiş veya birincil hücre hatları kez çip deneyleri içinde malzeme başlayan bereket nedeniyle tercih ve biyolojik değişkenlik azaltılmış. Ancak, bu modeller canlı organizmalar gerçek kromatin durumda sınırlı bir kesitini temsil eder. Böylece, hayvan modellerden elde edilen yağ doku örnekleri üzerinde çip gerçekleştirmek en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları için kritik bir ihtiyaç vardır.
Burada bir iletişim kuralı için verimli ChIP-seq histon modifikasyonları ve kahverengi yağ dokusundan (BAT) bir fareden izole olmayan histon proteinleri, açıklayın. Protokol genom çapında yerelleştirme faiz ve yağ depoları arasında morfolojik ve fizyolojik olarak ayrı bir dokudur yarasa epigenetik işaretleyicilerini proteinlerin soruşturma için optimize edilmiştir.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58682/58682fig1.jpg"> Şekil 1: ChIP doğrulama tarafından qPCR. Temsilcisi GPS2 chIP-qPCR analiz H3K9 metilasyonu ve GPS2 ve Pol2 bağlama düzeyini göreli değişiklikleri gösterilen yarasa farelerin, WT ve GPS2 AKO içinde genlerin NDUFV1 (solda) ve TOMM20 (sağda) hedef. Çubuk grafikler ile 3 çoğaltır örnek ortalaması temsil * p < 0,05 ve ** p < 0,01 olarak hesaplanan bir öğrenc...

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Kromatin Immunoprecipitation fare kahverengi yağ dokusunun

Burada verimli kromatin immunoprecipitation (ChIP) için bir protokol yüksek üretilen iş DNA sıralama (ChIP-seq) kahverengi yağ dokusundan izole bir fare (BAT), ardından açıklayın. Bu iletişim kuralı, hem histon değişiklikler eşleme ve genom çapında yerelleştirme sigara histon proteinleri ilgi içinde vivo, soruşturma için uygundur.

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Fareden izole kahverengi lipid dokusunda hem ester hem de ester dışı proteinlerin etkili ChIP dizilimi yapmak için kullanılan ölçülü. Tekniğin en büyük avantajı, protokolün lipid dokusundan kromatin ilişkili kompleksin etkin immünopresipitasyonu için optimize edilmiş olmasıdır. Kesiden önce, ötenazili fareyi %70 etanol ile püskürtün.Fareyi sırtı yukarı bakacak şekilde yerleştirin, ardından boyun boyunca bir kesik yapın. Daha sonra, omuzlar arasında doğrudan deri altında bat bulunan ve dikkatle beyaz yağ ince tabaka kaldırın. Oda sıcaklığında 150 RPM'de 15 dakika boyunca %1 formaldehit içeren 10 mililitre PBS'deki her BAT pedini çapraz bağlantı.15 dakika sonra, BAT'e 2,5 molar glisin ekleyerek çapraz bağlanmayı söndürün ve bu da 125 milimos'luk son konsantrasyonla sonuçlanır. Oda sıcaklığında 150 RPM döndürülerek, beş dakika boyunca bir shaker üzerine yerleştirin. Daha sonra, BAT pedini 500 mikrolitre hipotonik lysis tamponuna aktarın ve her BAT pedi için iki paslanmaz çelik boncuk ekleyin.Sonra, bir boncuk bazlı doku homogenizer doku parçalamak için kullanın. Maksimum güçte beş dakika ile başlayın. Gerekirse, doku homojenize ve tek hücreler ayrılana kadar süreyi uzatın.Numuneyi yeni bir tüpe aktarın ve 16,000 G'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin. 10 dakika sonra, yeni bir tüp içine supernatant aktarın ve buz üzerinde hücre pelet tutmak. Yüzen hücrelerin kaybını önlemek için 16, 000 G'de 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede süpernatantsan.Daha sonra, son supernatant atın ve bir kez proteaz inhibitörü ile SDS lysis tampon 300 mikrolitre birlikte her iki hücre pelet yeniden askıya. 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yat. Daha sonra, 200 ila 500 baz çifti uzunluğunda DNA parçaları üretmek için lysates sonicate.Sonication sonra, 16, 000 G dört derece santigrat 10 dakika santrifüj tarafından enkaz kaldırın. İmmünoenpresit gerçekleştirmek için, ChIP girişi olarak kromatin çözeltisinin %1'ini bir kenara koyun ve girdileri bir gecede dört santigrat derecede tutun. Daha sonra, kromatin çözeltisi bir mililitre ChIP antikor ekleyin ve aynı türün karşılık gelen pre-immün IgG veya normal IgG ile paralel immünopresideasyon gerçekleştirin.Alternatif olarak, hiçbir antikor kontrolü için kromatin çözeltisi bir mililitre kaydedin. Rotasyonla birlikte bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yat. Bağışıklık kompleksleri toplamak için, protein 50 mikrolitre ekleyin A agarose 50% bulamaç bağışıklık kompleksleri ve 150 RPM rotasyon ile dört derece santigrat bir saat kuluçka.Bir saat sonra, dört santigrat derece 1000 kez G bir dakika için santrifüj ile boncuk pelet. 0,45 mikrometre PVDF santrifüj filtre sütunlarında boncukların sıralı yıkamalarını, ilk olarak 500 mikrolitre düşük tuz yıkama tamponu ile sütunlarda boncukları aktararak sıkılığı artıran tamponlarla gerçekleştirin. Daha sonra, 2500 G.At üç dakika boyunca sütunlarda boncuk pelet akış-through atın.Düşük tuz yıkama prosedürlerine göre yüksek tuz yıkama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın. Daha sonra, lityum klorür ve son olarak bir kez TE ile prosedürleri tekrarlayın. Yıpranlar tamamlandıktan sonra, sütunlarda peletli boncuklara 300 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyerek bağışıklık komplekslerini aşındırın. 400 RPM'de bir çalkalayıcıda 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.Daha sonra, taze bir tüp içinde 2500 G üç dakika boyunca sütunaşağı dönerek elute toplamak. Bir gecede 65 santigrat derecede toplanan elute ve girdileri kuluçkaya yatırarak çapraz bağlantıları tersine çevirin. DNA'yı kurtarmak için, 300 mikrolitre fenol kloroform IAA'yı bire bir oranında ve girdap taki10 saniye boyunca elute ve girişlere ekleyin.Sonra, 21,000 G'de 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca aşağı dön. Pelet tutun ve supernatant atın. Bir mililitre soğuk %70 etanol ile peletyı yıkayın.Sonra 21,000 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca aşağı dön. Supernatant atın ve hava pelet kuru. Daha fazla işlem için 70 mikrolitre DNAE içermeyen su peletyeniden askıya.Burada Wildtype veya GPS2-A nakavt fareler izole BAT kullanarak ChIP Q PCR bir örnektir. GPS2'nin farklı hücre hatlarındaki nükleer kodlanmış mitokondriyal genlerin ekspresyonu için gerekli olduğu tespit edildiğinden, GPS2'nin işe alınması iki özel nükleer kodlanmış mitokondriyal gen üzerinde test edilmiştir. NDUFV1 ve TOMM20 yarasa farelerden yüksek mitokondri zenginleştirilmiş bir doku örnekleri olarak.GPS2 organizatörü doluluk GPS2-A nakavt fareler ve vahşi tip harf arkadaşları karşılaştırıldı. GPS2-A nakavt farelerden BAT'deki seçici hedef genler için GPS2 bağlanmasında beklenen bir azalma gözlendi. Burada açıklanan protokol kullanılarak, RNA polimeraz iki ve baskıcı histon işareti, H3K9ME3 artan bir bağlama, VAHŞI tip harf arkadaşları ile karşılaştırıldığında GPS2-A nakavt fareler den BAT kaydedildi.Bu sonuçlar seçilen nükleer kodlanmış mitokondriyal genler GPS2 işe onaylamak ve GPS2 H3K9ME3 birikimini önlemek için gerekli olduğunu göstermektedir ve böylece hedef organizatörler üzerinde kutup iki transkripsiyonel aktivite duraklama için gerekli. Burada açıklanan protokol, özellikle kahverengi yağ dokusu için optimize edilmiş olsa bile, diğer murine ve insan dokusundan ChIP yapmak için değerli bir aracı temsil eder. Fenokloroform ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.Bu nedenle, bu reaktif kullanırken her zaman duman kaputu altında çalışmak son derece önemlidir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Kromatin kompleksleri değiştirme özelliklerini bağlama toplu Kromatin analizi için sıralı tuz çekimi

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Genetik

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Kromatin İmmünenasyon ve Yüksek İş Kelejisi Kullanarak Salmonella Biyofilmde CsgD Düzenleyici Hedeflerin Keşfedilmesi (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

Tek Hücreli Genomik Uygulamalar için Yağ Dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...