Name: a bw reporter system for studying receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

يشكر المؤلفون المغنية إستر لتحرير اللغة. هذه الدراسة وأيده "مجلس البحوث الأوروبية" ضمن "البرنامج الإطاري السابع" للاتحاد الأوروبي (FP/2007-2013)/"منسق المنحة" رقم 320473-باكنك. وقدم المزيد من الدعم البرنامج "لجنة الميزنة" والتخطيط و "مؤسسة العلوم إسرائيل" أنا--الأساسية، وأنا-الأساسية في الكروماتين، والجيش الملكي النيبالي في تنظيم الجينات، ومؤسسة GIF، مؤسسة الأسرة لويس، منحة الأستاذية إيكرف، منح إسرائيل هلمهولتز والثقة روسيتريس (وجميعها إلى أ). وأيد هذه الدراسة أيضا "مؤسسة العلوم إسرائيل" (منحة 502/15)، "جائزة كأس للبحوث الطبية" ومنحة بحثية من المجتمع الإسرائيلي من أمراض الدم وطب نقل الدم (إلى S.E). O.M أستاذ "علم المناعة الجزيئية" تاج.

<ol>
	<li>Mandelboim, O., Lankry, D., Gazit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Natural Killer Cell Protocols. , 258-262 (2010).</li><li>Mandelboim, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+haemagglutinins+on+virus-infected+cells+by+NKp46+activates+lysis+by+human+NK+cells.">Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells.</a> Nature. 409 (6823), 1055-1060 (2001).</li><li>Stanietsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+TIGIT+with+PVR+and+PVRL2+inhibits+human+NK+cell+cytotoxicity.">The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17858-17863 (2009).</li><li>Stanietsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+TIGIT+inhibits+NK-cell+cytotoxicity+upon+interaction+with+PVR.">Mouse TIGIT inhibits NK-cell cytotoxicity upon interaction with PVR.</a> European Journal of Immunology. , (2013).</li><li>Gur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+Fap2+protein+of+Fusobacterium+nucleatum+to+human+inhibitory+receptor+TIGIT+protects+tumors+from+immune+cell+attack.">Binding of the Fap2 protein of Fusobacterium nucleatum to human inhibitory receptor TIGIT protects tumors from immune cell attack.</a> Immunity. 42 (2), 344-355 (2015).</li><li>Corrales-Aguilar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+detecting+virus-specific+antibodies+triggering+activation+of+Fcgamma+receptors.">A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcgamma receptors.</a> Journal of Immunoogical Methods. 387 (1-2), 21-35 (2013).</li><li>Corrales-Aguilar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+individual+patterns+of+virus-immune+IgG+effector+responses+in+humans.">Highly individual patterns of virus-immune IgG effector responses in humans.</a> Medical Microbiology and Immunology. 205 (5), 409-424 (2016).</li><li>Radinsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+ebolavirus+long+recovered+survivors+produce+GP-specific+Abs+that+are+of+the+IgG1+subclass+and+preferentially+bind+FcgammaRI.">Sudan ebolavirus long recovered survivors produce GP-specific Abs that are of the IgG1 subclass and preferentially bind FcgammaRI.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6054 (2017).</li><li>Elias, S., Kahlon, S., Kotzur, R., Kaynan, N., Mandelboim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obinutuzumab+activates+FcgammaRI+more+potently+than+other+anti-CD20+antibodies+in+chronic+lymphocytic+leukemia+(CLL).">Obinutuzumab activates FcgammaRI more potently than other anti-CD20 antibodies in chronic lymphocytic leukemia (CLL).</a> Oncoimmunology. 7 (6), e1428158 (2018).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).</li><li>Bar-On, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKp46+Recognizes+the+Sigma1+Protein+of+Reovirus:+Implications+for+Reovirus-Based+Cancer+Therapy.">NKp46 Recognizes the Sigma1 Protein of Reovirus: Implications for Reovirus-Based Cancer Therapy.</a> Journal of Virology. 91 (19), (2017).</li><li>Glasner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+Function,+and+Molecular+Properties+of+the+Killer+Receptor+Ncr1-Noe.">Expression, Function, and Molecular Properties of the Killer Receptor Ncr1-Noe.</a> Journal of Immunology. 195 (8), 3959-3969 (2015).</li><li>Glatzer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORgammat(+)+innate+lymphoid+cells+acquire+a+proinflammatory+program+upon+engagement+of+the+activating+receptor+NKp44.">RORgammat(+) innate lymphoid cells acquire a proinflammatory program upon engagement of the activating receptor NKp44.</a> Immunity. 38 (6), 1223-1235 (2013).</li><li>Gur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activating+receptor+NKp46+is+essential+for+the+development+of+type+1+diabetes.">The activating receptor NKp46 is essential for the development of type 1 diabetes.</a> Nature Immunology. 11 (2), 121-128 (2010).</li><li>Markel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+role+of+CEACAM1+protein+in+the+inhibition+of+activated+decidual+lymphocyte+functions.">Pivotal role of CEACAM1 protein in the inhibition of activated decidual lymphocyte functions.</a> Journal of Clinical Investigation. 110 (7), 943-953 (2002).</li></ol>

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

نقدم هنا بروتوكولا لإنشاء نظام مراسل للتحقيق في التفاعلات مستقبلات-يجند (انظر شكل مختصر لهذا البروتوكول1). البروتوكول ويتكون من ثلاثة أجزاء رئيسية: استنساخ بروتين تشيميريك، الذي يشمل المجال خارج الخلية لمستقبلات محددة تنصهر فيها المجال داخل الخلايا من CD3ζ، تعداء بلازميد يعبر عن البروتين الانصهار لخلايا وزن الجسم (مثلاً ، من انهانسر)، والكشف عن كمية من الماوس إيل-2 قبل أليسا. وينبغي التحقق من المنتج النهائي لكل من هذه الأجزاء بشكل مستقل: ينبغي التحقق من عملية الاستنساخ بالتسلسل الكامل للبروتين الانصهار في بلازميد الهدف، ينبغي التحقق من تعداء الخلايا البيولوجية عن طريق فحص التعبير عن وينبغي التحقق من مستقبلات للفائدة في الخلايا البيولوجية (مثلاً، بالتدفق الخلوي)، وعملية أليسا الضوابط الإيجابية العامة (مثلاً، المؤتلف مل-2) وكذلك مع الضوابط المحددة للخلايا ترانسفيكتيد الأسلحة البيولوجية؛ أي الأهداف التي تعبر عن يجند معروفة من المستقبلات للفائدة (مثلاً، أن CD48 صريحة يمكن أن تستخدم كعنصر إيجابي للخلايا البيولوجية التي تعبر عن ناغورني كاراباخ في الخلية 2B4 مستقبلات الخلايا). على سبيل المثال، قد تكون عملية استنساخ ناجحة، ولكن البروتين الانصهار لا يعبر عن الخلايا البيولوجية. في هذه الحالة، يجب تكرار انهانسر. وبدلاً من ذلك، إذا لم يكن هناك أي إشارة على مستوى الخلفية لوحة أليسا (خاصة بالنسبة لعناصر التحكم الإيجابي) قد فشل transfected الخلايا البيولوجية للتعبير عن المستقبلات (أو التعبير قد فقدت) أو مشكلة تقنية قد تكون حدثت أثناء عملية أليسا.
يمكن أن تكون تعديلات عدة على هذا البروتوكول مع الحفاظ على المبادئ العامة للإجراءات. وتشمل هذه التعديلات متجه المستخدمة للتعبير عن البروتين الانصهار، طريقة ترانسفيكتينج بلازميد الخلايا البيولوجية ومعلمات محددة تتصل بالحضانة وإليزا مثل نوع الهدف (مثل الخلايا، والأجسام المضادة، إلخ) ، عدد من الخلايا المستهدفة أو تركيز الأجسام المضادة إذا ذات الصلة (ونحن نستخدم خلايا 50,000 كل جسم ابتداء من جرعة مقدارها 0.5 ميكروغرام/جيدا وكذلك)، وقت الحضانة (ونحن نستخدم فترة حضانة 48 ساعة) وطاف وحدة التخزين التي يتم نقلها إلى لوحة أليسا.
هذا الأسلوب حساسة، محددة ويمكن قياسها كمياً بسهولة. أنها مثالية للفحص لوجود يغاندس لمستقبلات محددة (خاصة إذا لم يعترف يجند نفسه). بعد إعداد transfected الخلايا البيولوجية التي تعبر عن مستقبلات محددة، يمكن تجميد هذه الخلايا وتستخدم عند الحاجة للمزيد من التجارب. نحن وآخرون قد استخدمت هذا النظام بنجاح في الدراسات السابقة لاستكشاف التفاعلات مستقبلات-يجند (على سبيل المثال2،،من35،،من1213،14 ،،من1516)، وقد تم التحقق من النتائج التي توصلت إليها هذا النظام بأساليب أخرى. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب لدراسة تفعيل مستقبلات FcγR البشرية المختلفة من الأجسام المضادة، كما حدث لأجسام مضادة الفيروس في مصل الدم6،،من78 أو مع الأجسام المضادة ضد CD20 9.
أن هذا هو نظام مراسل الذي أعرب فيه عن الجزء خارج الخلية فقط للمستقبلات، النتائج التي تم الحصول عليها من هذا النظام ينبغي أن تستكمل بالمزيد من التجارب مع مستقبلات الذاتية، مثل فحوصات سيتوتوكسيسيتي مع الطبيعية الخلايا القاتلة (NK) لدراسة التفاعلات مع ناغورني كاراباخ الخلايا مستقبلات. وعلاوة على ذلك، بعض التفاعلات يجند/مستقبلات لا ينتج في إفراز mIL-2 منظومة مراسل، ولذلك قد أغفلت. وباﻹضافة إلى ذلك، كما هو الحال في أي برنامج الإعداد التجريبية، النتائج وينبغي التحقق من معلمات مختلفة كما هو موضح أعلاه. وهذا مهم بشكل خاص في الحالات التي يكون فيها مقارنة بين اثنين الشروط المطلوبة (مثلاً، تفعيل مستقبلات Fc نفسه من الأجسام المضادة المختلفة). من المهم أيضا التحقق من أن حساسية تفاعل مستقبلات يجند محددة داخل نطاق النظام الخطي. وإلا قد يؤدي ذلك إلى قيم التشبع الذي قد يحول دون إجراء مقارنة صحيحة عبر الشروط. يمكن تحقيق ذلك باستخدام منحنى قياسي 2 مل وكذلك عن طريق توليد منحنى استجابة لجرعة مع يجند مختبرة (في حالة تشبع القيم، التجريبية ينبغي أن يتم تعديل المعلمات؛ مثلاً، حجم أصغر من المادة طافية ينبغي تحليله بإليزا). آخر إمكانية الحد من هذا النظام هو استخدام الخلايا المستهدفة مع الإفرازات الذاتية لشركة مالونغوشي-2 (مثلاً، خلايا الفأر T) التي يمكن أن يخفيها إفراز الخلايا BW إيل-2. للتغلب على هذه الأحداث عادية جداً التي تقتصر على خلايا الماوس، يمكن تحسين هذا النظام المراسل باستخدام مراسل مختلفة (مثلاً، التجارة والنقل) التي لا يعبر عنها بواسطة الخلايا الهدف.

نظام مراسل الحرب البيولوجية تقنية لدراسة التفاعلات مستقبلات-يجند1. هذا النظام مفيد خصوصا عندما يجند لمستقبل محدد غير معروف أو تجارب مع يجند الذاتية ويصعب من الناحية الفنية. يمكن استخدامه أيضا لدراسة الربط من الأجسام المضادة للبشرية FcγRs. ويستند الأسلوب معربا عن بروتين تشيميريك في خلايا الفأر الأسلحة البيولوجية. ويتألف هذا البروتين تشيميريك من المجال خارج الخلية من المستقبلات للفائدة التي تنصهر فيها إلى المجالات داخل الخلايا وترانسميمبراني من سلسلة ζ الماوس. ملزمة يغاندس المناسبة للمستقبلات يؤدي إلى إفراز الماوس إيل-2، التي يمكن بسهولة الكشف عنها بواسطة أليسا، كما هو مبين في الشكل 1. هذا الأسلوب حساسة ومحددة لمستقبلات فردية، سهلة التشغيل، واستنساخه بدرجة عالية. وهكذا فإنه يمكن أن تكمل أدوات إضافية لدراسة التفاعلات مستقبلات-يجند. على سبيل المثال، يمكن استخدام الكشف عن تفعيل FcγRs البشرية بالأجسام المضادة أو بواسطة مصل الدم البشري التي تحتوي على الفيروسات أو الشاشة عدة خطوط الخلية لوجود يجند لمستقبل معين (حتى ولو لم يتم تحديد يجند نفسه) الأجسام المضادة. على الرغم من أن الخلايا المناعية الأولية إكسبريس FcγRs الذاتية، وهم عموما من الصعب التعامل معها وعادة التعبير عن مستقبلات Fc عدة.
أننا استخدمنا هذا النظام بنجاح في كثير من دراساتنا لوصف التفاعلات مستقبلات-يجند. وتشمل هذه تحديد ضرورة كما يجند مستقبلات الخلية ناغورني كاراباخ NKp462، تحديد PVR ونيكتين-2 يغاندس للإنسان والفأر3،تيجت4، وتبين أن fusobacterium nucleatum يربط بكتيريا و ينشط تيجت البشرية5. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت خلايا الأسلحة البيولوجية التي تعبر عن مستقبلات Fc بنجاح للكشف عن الأجسام المضادة للفيروسات في المرضى سيرا6،،من78. على وجه التحديد، أنشأنا مؤخرا الخلايا البيولوجية التي تعبر عن FcγRs البشرية للكشف عن التنشيط FcR التفاضلية للأجسام المضادة-CD20 المستخدمة لعلاج سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL)9. الأهم من ذلك، وقد تم التحقق من صحة نتائج نظام مراسل الحرب البيولوجية في تجارب تكميلية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>K-3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IL-2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>503702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse IL-2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>503804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plates</td>
			<td>De-groot</td>
			<td>60-655061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Mercury</td>
			<td>MBS3458105GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peroxidase streptavidin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-042-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB</td>
			<td>SouthernBiothech</td>
			<td>0410-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bw reporter system for studying receptor-ligand interactions

التفاعلات بين المستقبلات ويغاندس تشكل عملية بيولوجية أساسية. ومع ذلك، المباشر التجارب مع الخلايا التي تعبر عن مستقبلات الأصلية وتشكل تحديا يجند منذ يجند مستقبلات محددة قد تكون غير معروفة وإجراءات تجريبية مع يجند الأصلي يمكن أن يكون معقداً من الناحية الفنية. لتخطي هذه العقبات، يصف لنا نظام مراسل للكشف عن الملزمة والتنشيط مستقبلات محددة من يجند للفائدة. في هذا النظام مراسل، هو مترافق المجال خارج الخلية لمستقبلات محددة بالماوس CD3ζ وثم يتم التعبير عن هذا البروتين تشيميريك في خلايا الفأر الأسلحة البيولوجية. يمكن ثم تكون هذه الخلايا BW transfected المحتضنة مع أهداف مختلفة (مثلالخلايا أو الأجسام المضادة). التنشيط لمستقبل transfected يؤدي إلى إفراز interleukin-2 الماوس (mIL-2) التي يمكن الكشف عنها بواسطة المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA). وهذا النظام مراسل له مزايا حساسة ومحددة لمستقبل واحد. وبالإضافة إلى ذلك، مستوى التنشيط مستقبلات محددة يمكن قياسها كمياً بسهولة ويمكن استخدامها حتى في الحالات التي يكون فيها يجند المستقبلات غير معروف. وقد نفذت بنجاح هذا النظام في كثير من دراساتنا لوصف التفاعلات مستقبلات-يجند. وقد استخدمنا مؤخرا هذا النظام لدراسة تفعيل مستقبلات Fcγ البشرية (FcγRs) بالأجسام المضادة [مونوكلونل] مختلفة-CD20 في الاستخدام السريري.

ويوضح الشكل 3 نتائج التجربة مع نظام مراسل الحرب البيولوجية. في هذه التجربة، كانت الخلايا CLL المحتضنة مسبقاً مع الأجسام المضادة المختلفة-CD20 (rituximab وأوبينوتوزوماب) وثم شارك المحتضنة مع transfected الخلايا البيولوجية التي تعبر عن CD16a-CD3ζ. وأجريت تجارب مماثلة في الدراسة لدينا9. ويعرض الشكل 3 ألف صورة للوحة أليسا الخام حيث يناظر كثافة اللون بتركيز 2 مل. وأجريت التجربة في ثلاث نسخ. وشملت هذه التجربة عدة عناصر تحكم: CLL الخلايا المحتضنة مع خلايا وزن الجسم أونترانسفيكتيد الوالدين (الصف العلوي) وخلايا CLL المحتضنة مع الخلايا البيولوجية التي تعبر عن CD16a-CD3ζ ولكن دون جسم أو جسم تحكم (ستة آبار في الصف الثاني على اليسار) . الحضانة للخلايا البيولوجية التي أعرب عنها CD16 مع الخلايا CLL التي كانت مسبقاً المحتضنة مع الأجسام المضادة-CD20 الناجمين عن إفراز كبير شركة مالونغوشي-2 مقارنة بالمستوى 2 مل من آبار المراقبة. الأهم من ذلك، ما قبل الحضانة للخلايا CLL مع أوبينوتوزوماب CD20 مكافحة المنشط CD16 أكثر بقوة من rituximab، معروف الحقائق التي قد لخص بنظامنا. يظهر الصف الأخير تنازلي تركيزات محددة مسبقاً المؤتلف مل-2 (بدون إضافة الخلايا). ليس لديه ميل-2 كذلك الحق في الصف الأخير ويمثل قراءة الخلفية، التي تبدو مماثلة لمراقبة الآبار. ويعرض الشكل 3 (ب) التحديد الكمي لنتائج لوحة أليسا هو موضح في الشكل 3 ألف. مستويات الكثافة البصرية (OD) تم تحويلها إلى شركة مالونغوشي-2 التركيزات استناداً إلى المنحنى المعياري مع المؤتلف مل-2. ويعرض الشكل 3 تجربة استجابة جرعة حيث كانت قبل المحتضنة مع خلايا CLL جرعات مختلفة من الأجسام المضادة وثم المحتضنة مع خلايا BW معربا عن CD16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig1.jpg"> رقم 1: التمثيل التخطيطي للنظام مراسل الحرب البيولوجية- ستابلي هي transfected الخلايا BW5147 مع الجزء خارج الخلية من مستقبلات مختلفة تنصهر إلى مجالات ترانسميمبراني وهيولي الماوس سلسلة CD3ζ (تشيميريك ريكتور-CD3ζ). تفعيل مستقبلات-CD3ζ محددة بما ينتج إفراز mIL-2 التي يمكن الكشف عنها بواسطة أليسا يجند. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig2.jpg"> رقم 2: هيكل المستقبلات-CD3ζ تشيميريك، وتصميم كبسولة تفجير [بكر- (A) الهيكل العام لمستقبلات الخلية تنصهر فيها مجالات الماوس CD3ζ ترانسميمبراني وداخل الخلايا. (ب) المجال خارج الخلية للمستقبلات اتسع نطاق مع تمهيدي 3 ' التي شملت أيضا النيوكليوتيدات CD3ζ. (ج) المجالات داخل الخلايا وترانسميمبراني من CD3ζ تم تضخيمه مع تمهيدي 5 ' التي شملت أيضا مستقبلات النيوكليوتيدات. (د) في رد فعل PCR النهائي، استخدمت كلا الجزأين، التي قد تداخل متواليات، كقالب الحمض النووي. في كل اللوحات الشكل، مجالات مختلفة من البروتين هي مرمزة ومحاصر في المستطيلات الزرقاء (سلسلة CD3ζ) والمستطيلات الحمراء (تسلسل مستقبلات). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig3.jpg"> الشكل 3: رسم توضيحي للمنتج النهائي للنظام مراسل الحرب البيولوجية- (أ، ب، ج) وكانت الزنزانات CLL المحتضنة مسبقاً مع أو بدون الأجسام المضادة-CD20 اثنين (rituximab وأوبينوتوزوماب) أو جسم تحكم. وبعد ذلك كانت المحتضنة خلايا جسم زمنياً مع الوالدين BW الخلايا أو الخلايا البيولوجية التي تعبر عن CD16a-CD3ζ. وكان يحدد مستوى شركة مالونغوشي-2 في المادة طافية أليسا. (أ) صورة لوحة أليسا الخام. كثافة اللون يشير إلى تركيز شركة مالونغوشي-2 في المادة طافية. وأجريت التجربة في ثلاث نسخ. الصف السفلي يبين قراءات أليسا في خفض تركيزات المؤتلف مل-2 التي تم تحليلها في نفس اللوحة. (ب) التحديد الكمي لإليزا القراءة المبين في (أ). حسبت مستويات شركة مالونغوشي-2 استخدام منحنى قياسي لشركة مالونغوشي-2. (ج) ألف جرعة استجابة التجربة حيث كانت قبل المحتضنة مع خلايا CLL جرعات مختلفة من الأجسام المضادة وثم المحتضنة مع خلايا BW معربا عن CD16a-CD3ζ. ، ف < 0.001؛ اختبار t للطالب (ب) أو ANOVA مع مقارنات متعددة (ج). وكان المقارنة فقط في (ج) التي لم تكن تختلف اختلافاً كبيرا rituximab ومراقبة Ab في تركيز الأولى (0.01 ميكروغرام/مل). أشرطة الخطأ يمثل الانحراف المعياري تريبليكاتيس. وأجريت تجارب مماثلة كجزء من واحدة من لدينا الدراسة الأخيرة9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

هذا البروتوكول يصف كيفية إنشاء نظام مراسل التي يمكن استخدامها لتحديد وتقدير حجم التفاعلات مستقبلات-يجند.

نظام مراسل الحرب البيولوجية لدراسة التفاعلات مستقبلات-يجند

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...

شالوم.نظام مراسل BW تمكن من دراسة التفاعلات مستقبلات ligand. ومن المفيد للغاية في الحالات التي يكون فيها يغاند مستقبلات معينة غير معروف أو في الحالات التي تكون فيها التجارب مع ليغاند الذاتية صعبة من الناحية الفنية. هذه الطريقة حساسة ومحددة لمستقبلات الفردية، وسهلة التشغيل وتكرار.إثبات الإجراء سيكون شيرا كالون، وهو ما بعد الدكتوراه لمختبري. في اليوم السابق لtransfection، لوحة 10 لوحات مع 10 ملليلتر من 100، 000 BW5147 الخلايا، وتكملة لPMI. ثم ضع 100 ميكروغرام من pcDNA3 plasmid في أنبوب.إضافة خلات الصوديوم في 5.3 الأسي إلى الأنبوب. بعد ذلك، إضافة 2.5 وحدات تخزين من 100٪ الإيثانول إلى خليط البلازميد. ثم احتضان خليط البلازميد بين عشية وضحاها في ناقص 20 درجة مئوية.بعد 24 ساعة من طلاء خلايا BW، قم بجمع الخلايا في أنبوبين 50 ملليلتر. ثم الطرد المركزي الخلايا في 515 ز لمدة خمس دقائق، والتخلص من الفائق. إعادة تعليق في بيلوتون RPMI دون إضافات وتكرار الطرد المركزي.Resuspend بيليه الناتجة في 1 ملليلتر من RPMI دون إضافات. نقل بيليه resuspended إلى 4 سم cuvet على الجليد. الطرد المركزي البلازميد التي خضعت لهطول الأمطار الإيثانول.ثم غسل البلازميد مع ملليلتر واحد من 70٪ الإيثانول. وكرر الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة أخرى. إزالة كل من الإيثانول، والسماح بيليه لتجف جزئيا.ثم إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولترات من RPMI مسخ مسبقا، دون إضافات. بعد ذلك، إضافة البلازميد resuspended إلى الخلايا في cuvet. احتضان الخلايا على الجليد لمدة خمس دقائق.بعد ذلك، الكهربائي الخلايا. ثم نقل الخلايا الكهربائية إلى أنبوب 50 ملليلتر. إضافة 50 ملليلتر من المتوسط الكامل للأنبوب والطرد المركزي لمدة خمس دقائق، في 515 غرام.تجاهل عظمى، وإعادة تعليق الخلايا في 50 ملليلتر من المتوسط الكامل. ثم قم بطبق الخلايا في أطباق ثقافة 24 بئرًا ، واحتضان الخلايا لمدة 48 ساعة. بعد هذا، إضافة ملليلتر واحد من المتوسط الكامل، تستكمل مع 10 ملليغرام لكل ملليلتر من G418 إلى كل بئر.48 ساعة في وقت لاحق، والتخلص من ملليلتر واحد من حجم أعلى من كل بئر. ثم إضافة ملليلتر واحد من المتوسط الكامل تكملها خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من G418 إلى كل بئر. استخدام 000 50 خلية من خلايا بي دبليو المُصابة بالعدوى مع أهدافها المنشودة، في بئر واحد من صفيحة 96 بئراً.احتضان لوحة لمدة 48 ساعة. ثم تجمدي الصفيحة عند 20 درجة مئوية معطف لوحة ELISA مع المضادة الماوس IL-2 الأجسام المضادة.مكان 05 ميكروغرام من المضادة للماوس IL - 2 ، في حجم 50 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في كل بئر. احتضان لوحة المغلفة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. استخدام فترة حضانة قصيرة عند 37 درجة مئوية، لإذابة خلايا BW المجمدة، التي كانت في السابق تحتضن مع أهدافها.ثم الطرد المركزي لوحة، ونقل 100 ميكرولترات من عظمى من كل بئر إلى لوحة ELISA المغلفة مسبقا. و احتضنت 37 درجة مئوية لمدة ساعتين بعد هذا إضافة البيوتين المضادة للماوس IL-2 إلى لوحة ELISA.ثم بعد الحضانة والغسيل، إضافة HRP متقارن streptavidin إلى لوحة. بعد الحضانة والغسيل، أضف 100 ميكرولترات من محلول الركيزة TMB، إلى كل بئر من لوحة ELISA. وأخيرا قراءة لوحة ELISA في 650 نانومتر.في هذا المثال، كانت خلايا CLL محتضنة مسبقاً مع أجسام مضادة لـ CD20 مختلفة. ثم شارك في احتضان مع خلايا BW المصابة التي تعبر عن مستقبلات FC CD16، قبل أن يتم تحليل مع ELISA. بعد التحليل مع ELISA تم تحديد النتائج كميا.تم تحويل مستويات الكثافة البصرية، إلى تركيزات الماوس IL-2، استنادا إلى المنحنى القياسي. في تجربة إضافية، كانت جرعات مختلفة من الأجسام المضادة لـ CD20 محتضنة مسبقًا مع خلايا CLL. ثم احتضان مع خلايا BW المصابة.يحتوي الجسيم على أربعة أجزاء رئيسية. الاستنساخ، نقل خلايا BW، التنشيط و ELISA. وينبغي التحقق من كل جزء من الأجزاء بشكل مستقل.بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تجارب إضافية مع الخلايا التي تعبر عن مستقبلات الذاتية، مثل قتل الأحماض مع خلايا NK لدراسة التفاعلات مع مستقبلات الخلايا NK. لقد استخدمنا هذا النظام لاكتشاف يغاندس جديدة من مستقبلات الخلايا NK. على سبيل المثال، هيماغلوتينين هو يغاند من NKp46، و PVL هو يغاند من TG.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

دراسة العدوان في ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

دراسة النشوء الأحيائي الأغشية مع الفحص الجيني مراسل Luciferase المستندة

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

انقسام اليوبيكويتين الخميرة يستند الغشاء الهجين ثنائي (الأسطورة) النظام : أداة قوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

يرتبط فخ كروموسوم لتحديد الحمض النووي تفاعلات طويلة المدى

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

الكشف عن تفاعلات البروتين في النبات باستخدام عبارة الإسفار ثنائي الجزيء المتوافقة التكملة (BiFC) نظام

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

الطمع القائم على فحص التفاعل خارج الخلية (AVEXIS) للكشف قابلة منخفضة تقارب التفاعلات مستقبلات يجند خارج الخلية

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

RNA محفز كمراسلة لفحص الحمض النووي الريبي أدوية ضد التحرير في المثقبيات

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

بنقل العدوى إلى خلايا RAW264.7 مع luciferase المراسل مراسل جين

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

دراسة نظام لمراقبة الجودة من البروتين<em&gt; D. discoideum</em&gt; عن طريق درجة الحرارة التي تسيطر التصوير الخلية الحية

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...