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November 26th, 2018
DOI :
November 26th, 2018
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Title
0:45
Reagents Preparation
2:01
Plating Fibroblasts for Reprogramming: Day 0
5:09
Initiation of Reprogramming: Day 1
9:28
Results: Efficient Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into iPSCs
11:16
Conclusion
Transcript
अपनी उच्च दक्षता के कारण, यह विधि मानव रोग का अध्ययन करने और उपन्यास स्टेम सेल चिकित्सा विकसित करने के लिए एक उपकरण के रूप में प्रेरित pluripotent स्टेम सेल, या IPSCs को आगे बढ़ा सकती है। इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ प्राथमिक मानव फाइब्रोब्लास्ट से उच्च गुणवत्ता वाले एकीकरण मुक्त IPSCs उत्पन्न करने की क्षमता है जिसमें पुनर्कार्यक्रम, संबंधित रोग, वृद्ध और सेनेसेंट फाइब्रोब्लास्ट शामिल हैं। इस विधि की सफलता फाइब्रोब्लास्ट की इष्टतम आरएनए ट्रांसफैक्शन दक्षता पर निर्भर करती है।
और एक ट्रांसफैक्शन बफर के पीएच को समायोजित करना इसे प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। शुरू करने के लिए, ताजा कम सीरम माध्यम की 500 मिलीलीटर और 100 मिलीलीटर कमरे के तापमान पूर्व गर्म बोतलों का उपयोग करके ट्रांसफेक्शन बफर तैयार करें। पीएच मीटर के ग्लास इलेक्ट्रोड को बफर में डालकर 500 मिलीलीटर बोतल में माध्यम के आधार पीएच को मापें, और पीएच पढ़ने से पहले एक मिनट तक प्रतीक्षा करें।
पीएच को समायोजित करने के लिए, 500 मिलीलीटर बोतल में एक मोलर सोडियम हाइड्रोक्साइड के तीन से चार मिलीलीटर जोड़ें। बोतल को बंद करें और अच्छी तरह से मिलाएं। पांच मिनट के इंतजार के बाद बोतल खोलकर पीएच मीटर के इलेक्ट्रोड को बफर में डालें।
पीएच मीटर पर रीडिंग स्थिर होने तक इंतजार करें। पीएच 8.15 से 8.17 तक पहुंचने तक एक मोलर सोडियम हाइड्रोक्साइड की छोटी मात्रा जोड़ना जारी रखें, जिससे प्रक्रिया के दौरान कई बार पीएच मीटर को कैलिब्रेट करना सुनिश्चित हो जाए। ट्रांसफैक्शन बफर को फ़िल्टर करने के लिए 0.22 माइक्रोमीटर वैक्यूम फिल्ट्रेशन सिस्टम का उपयोग करें।
कम से कम हवा अंतरिक्ष के साथ पांच मिलीलीटर ट्यूबों में निष्फल बफर अलीकोट। सत्यापित करें कि पुनर्प्रोग्राम किए जाने वाले फाइब्रोब्लास्ट 40% से 60% तक की नरमी पर हैं। डीपीबीएस के चार मिलीलीटर को 15 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें, और 100 माइक्रोलीटर को रीकॉम्बिनेंट मानव लेमिनिन 521 जोड़ें।
ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं। एक छह अच्छी थाली के तीन कुओं में पतला recombinant मानव टुकड़े टुकड़े ५२१ के प्रति अच्छी तरह से एक मिलीलीटर जोड़ें । दो घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इस लेपित प्लेट को इनक्यूबेट करें।
इस इनक्यूबेशन के दौरान फाइब्रोब्लास्ट विस्तार माध्यम के छह मिलीलीटर गर्म और चढ़ाना माध्यम के चार मिलीलीटर ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए । 200 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता पर 100 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर और बी 18आर की अंतिम एकाग्रता पर बुनियादी एफजीएफ के साथ चढ़ाना माध्यम को पूरक करें। 40% से 60% तक की उदारता वाले फाइब्रोब्लास्ट से खर्च किए गए माध्यम को सावधानीपूर्वक जाता है।
डीपीबीएस के पांच मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला। ट्रिप्सिन ईडीटीए के तीन मिलीलीटर जोड़ें और ट्रिप्सिन ईडीटीए के साथ कोशिकाओं को कवर करने के लिए प्लेट को धीरे-धीरे रॉक करें। अतिरिक्त तरल पदार्थ को एस्पिरेट करें, जिससे ट्राइप्सिन के लगभग 500 माइक्रोलीटर गिरते हैं, और फाइब्रोब्लास्ट को तीन मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करते हैं।
इनक्यूबेटर से प्लेट हटाने के बाद, दृढ़ता से लेकिन ध्यान से कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने के लिए थाली के पक्ष पर टैप करें। माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं को देखें कि क्या वे अलग किया गया है की जांच करने के लिए । ट्राइप्सिन ईडीटीए को बेअसर करने के लिए अलग कोशिकाओं में फाइब्रोब्लास्ट विस्तार माध्यम के पांच मिलीलीटर जोड़ें।
कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर शंकु नली में ले जाएं और उन्हें अच्छी तरह से मिलाएं। एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती, तो पहले से तैयार पूर्व गरम चढ़ाना माध्यम के चार मिलीलीटर में 12, 000 कोशिकाओं पिपेट । इनक्यूबेटर से लेपित प्लेट को हटाने के बाद, कुओं से पतला लेमिनिन 521 को हटा दें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि कुओं की सतह सूखी नहीं है।
धीरे-धीरे प्लेटिंग माध्यम में होने वाली कोशिकाओं को फिर से रीसल्पेंड करें और प्रत्येक लेपित अच्छी तरह से सेल निलंबन का एक मिलीलीटर जोड़ें। चढ़ाया कोशिकाओं को कम ऑक्सीजन या ऑक्सीजन के साथ एक त्रिकोणीय गैस ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें 5% के लिए सेट और फिर धीरे लेकिन अच्छी तरह से एक ऊपर नीचे के बीच बारी से कोशिकाओं को तितर-बितर, तो सही गति छोड़ दिया है, और गति दो और बार दोहराने, यकीन है कि थाली भंवर नहीं कर रही है । कोशिकाओं को रात भर इनक्यूबेट करें।
इस बीच, एक 15 मिलीलीटर शंकु नली के लिए पुनर्प्रोग्रामिंग माध्यम के चार मिलीलीटर जोड़ें, और यह एक ढीला टोपी के साथ कम ओ दो इनक्यूबेटर में जगह के लिए रात भर संतुलन । ट्रांसफैक्शन से कम से कम एक घंटे पहले, कम ओ दो इनक्यूबेटर से समतुल्य पुनर्प्रोग्रामिंग माध्यम को हटा दें। 100 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता में टीएफजीएफ जोड़ें, और बी 18आर को 200 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें, और अच्छी तरह से मिलाएं।
एक समय में एक अच्छी तरह से काम करना, खर्च किए गए माध्यम को हटाने के लिए एक मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें। और इसे रीप्रोग्रामिंग माध्यम के एक मिलीलीटर के साथ बदलें, जिसे टीएफजीएफ और बी 18आर के साथ पूरक किया गया है। कोशिकाओं के साथ प्लेट को कम ऑक्सीजन इनक्यूबेटर में वापस ले जाएं।
फाइब्रोब्लास्ट ट्रांसफैक्शन शुरू करने के लिए, पहले कमरे के तापमान पर लगभग एक घंटे के लिए ट्रांसफैक्शन बफर के एक एलिक्विट को बराबर करें। संशोधित एमआरएए के एक 33 माइक्रोलीटर एलिकोट और मिरना के 14 माइक्रोलीटर एलिकोट को नकारात्मक 80 डिग्री सेल्सियस से निकालें, और उन्हें लगभग तीन से पांच मिनट तक कमरे के तापमान पर गर्म करें। उन्हें एक माइक्रोफ्यूज में संक्षेप में स्पिन करें।
लगभग तीन से पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान के लिए ट्रांसफैक्शन अभिकर् ता को गर्म करें। ट्यूब को दो से तीन बार उलटा करने के लिए अभिवार्जर मिश्रण और यह एक माइक्रोफ्यूज में संक्षेप में नीचे स्पिन । कमरे के तापमान के 279 माइक्रोलीटर को आरएनए मुक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और ट्रांसफैक्शन रीएजेंट के 31 माइक्रोलीटर जोड़ें।
एक मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पाइपिंग और इनक्यूबेट करके अच्छी तरह से मिलाएं। कमरे के तापमान ट्रांसफेक्शन बफर के 132 माइक्रोलीटर संशोधित एमआरए के 33 माइक्रोलीटर एलिकोट में जोड़ें, और मिश्रण करने के लिए धीरे-धीरे पिपेट करें। मिरना की नकल के 14 माइक्रोलीटर एलिकोट में कमरे के तापमान ट्रांसफेक्शन बफर के 102.6 माइक्रोलीटर जोड़ें और मिश्रण करने के लिए धीरे-धीरे पिपेट करें।
संशोधित एमआरएना के ट्रांसफेक्शन मिश्रण को तैयार करने के लिए, 310 माइक्रोलीटर ट्रांसफैक्शन बफर के 165 माइक्रोलीटर जोड़ें, ट्रांसफैक्शन बफर के 165 माइक्रोलीटर में ट्रांसफैक्शन रीएजेंट मिक्स, संशोधित एमआरएना मिश्रण। पिपेट मिश्रण करने के लिए। मिरना नकल के ट्रांसफेक्शन मिश्रण को तैयार करने के लिए, 310 माइक्रोलीटर ट्रांसफैक्शन बफर के 116.6 माइक्रोलीटर जोड़ें, 116.6 माइक्रोलीटर ट्रांसफेक्शन बफर, मिरना नकल मिश्रण में ट्रांसफैक्शन रीएजेंट मिक्स करें।
संशोधित एमआरए और मिरना नकल के साथ ट्रांसफैक्शन बफर को जटिल करने की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए अच्छी तरह से और इनक्यूबेट मिलाएं। कम ऑक्सीजन इनक्यूबेटर से कोशिकाओं के साथ थाली निकालें। प्रत्येक कुएं में ड्रॉप वार करें, जटिल, संशोधित एमआरएन युक्त ट्रांसफैक्शन मिश्रण के प्रति अच्छी तरह से 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।
धीरे से लेकिन अच्छी तरह से एक ऊपर नीचे के साथ थाली उत्तेजित, तो सही गति ट्रांसफैक्शन परिसरों को तितर-बितर करने के लिए छोड़ दिया । ट्रांसफेक्शन मिश्रण के प्रति अच्छी तरह से 66.7 माइक्रोलीटर जोड़ें जिसमें जटिल मिरना प्रत्येक अच्छी तरह से ड्रॉप वार की नकल करता है। धीरे से लेकिन अच्छी तरह से एक ऊपर नीचे के साथ थाली उत्तेजित, तो सही गति ट्रांसफैक्शन परिसरों को तितर-बितर करने के लिए छोड़ दिया ।
प्लेट को कम ऑक्सीजन के साथ त्रि-गैस इनक्यूबेटर में संक्रमित कोशिकाओं के साथ रखें। धीरे से लेकिन अच्छी तरह से एक ऊपर नीचे के साथ थाली आंदोलन द्वारा ट्रांसफेक्शन परिसरों तितर-बितर, तो सही गति छोड़ दिया । अगले दिन माध्यम बदलने से पहले इनक्यूबेटर में 16 से 20 घंटे के लिए संक्रमित कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें ।
एक 15 मिलीलीटर शंकु नली के लिए पुनर्प्रोग्रामिंग माध्यम के चार मिलीलीटर जोड़ें, और यह एक ढीला टोपी के साथ कम ओ दो इनक्यूबेटर में जगह रातोंरात संतुलन के लिए । अगली सुबह, 5एफजीएफ और बी 18आर के साथ पूरक ताजा पूर्व-समतुल्य माध्यम के साथ माध्यम युक्त ट्रांसफैक्शन को प्रतिस्थापित करें और प्रोटोकॉल में वर्णित ट्रांसफैक्शन आहार के साथ जारी रखें। पुनर्प्रोग्रामिंग के लिए एक छह अच्छी तरह से प्रारूप पकवान के एक कुएं में सफल चढ़ाना के बाद, फाइब्रोब्लास्ट बहुत विरल दिखाई दिया ।
पहले सफल ट्रांसफैक्शन के 24 घंटे बाद फाइब्रोब्लास्ट्स ने अपने धुरी आकार को खो दिया और एक अधिक गोल आकृति विज्ञान अपनाया। पहले तीन ट्रांसफैक्शन के दौरान, सेल घनत्व धीरे-धीरे और लगातार सात और आठ दिनों के बीच होने वाले प्रसार में एक स्पष्ट फट के साथ वृद्धि हुई। 10 दिन तक, कोशिकाओं को काफी हद तक ढुलमुल दिखाई दिया ।
पहले आईपीएससी कॉलोनियां 11 दिन की शुरुआत में दिखाई दीं । 15 से 17 दिनों तक, IPSC कालोनियों बड़े और स्पष्ट और स्पष्ट रूप से आसपास और पूरी तरह से पुनर्प्रोग्राम फाइब्रोब्लास्ट से अलग हो गया । pluripotency मार्कर TRA-1-60 के लिए इम्यूनोस्टेटिंग उच्च पुनर्प्रोग्रामिंग दक्षता की पुष्टि की ।
इस प्रोटोकॉल में रीप्रोग्रामिंग की कम दक्षता के लिए सबऑप्टिमल प्लेटिंग घनत्व सबसे आम कारण है। यदि चढ़ाना घनत्व बहुत कम था, तो बड़े एसेलुलर दिग्गज पैच दिखाई दिए और आईपीएससी कॉलोनियां नहीं बनतीं। पुनर्प्रोग्राम्ड कोशिकाओं के कमजोर पड़ने के बाद, IPSCs एकल उपनिवेशों के रूप में बढ़ी और फाइब्रोब्लास्ट से आसानी से अलग हो गई।
वे शिथिल पैक किए गए थे और व्यक्तिगत कोशिकाओं में अपेक्षाकृत बड़ा साइटोप्लाज्मिक क्षेत्र था। चार से सात दिनों के दौरान, IPSCs ने परिभाषित किनारों के साथ एक विशेषता कसकर पैक कॉलोनी का गठन किया। कॉलोनी के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं ने प्रमुख नाभिक के साथ एक बड़ा परमाणु अंश दिखाया।
रोगी फाइब्रोब्लास्ट को फिर से प्रोग्राम करने के बाद, परिणामस्वरूप आईपीएससी को विभिन्न प्रकार की दैहिक कोशिकाओं में विभेदित किया जा सकता है ताकि रोग पैदा करने वाले तंत्र को स्पष्ट किया जा सके या उपन्यास पुनर्योजी कोशिका-आधारित चिकित्सीय विकसित किया जा सके।
यहाँ हम एक नैदानिक प्रासंगिक, उच्च दक्षता, फीडर मुक्त विधि का वर्णन करने के लिए प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं में मानव प्राथमिक fibroblasts reprograming संशोधित mRNAs एंकोडिंग reprogram कारकों और परिपक्व microRNA-367/ भी शामिल reprogramminging दक्षता का आकलन करने के लिए तरीके हैं, क्लोनल iPSC कालोनियों का विस्तार, और pluripotency मार्कर तर्-1-60 की अभिव्यक्ति की पुष्टि करें ।
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