9.9K Views
•
11:38 min
•
November 26th, 2018
DOI :
November 26th, 2018
•0:04
Title
0:45
Reagents Preparation
2:01
Plating Fibroblasts for Reprogramming: Day 0
5:09
Initiation of Reprogramming: Day 1
9:28
Results: Efficient Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into iPSCs
11:16
Conclusion
Transcript
På grunn av sin høye effektivitet, denne metoden kan videre fremme indusert pluripotente stamceller, eller IPSCs som et verktøy for å studere menneskelig sykdom og utvikle nye stamcellebehandlinger. Den største fordelen med denne protokollen er evnen til å generere høykvalitets integrasjon gratis IPSCer fra primære menneskelige fibroblaster, inkludert vanskelig å omprogrammere, sykdom forbundet, alderen, og senescent fibroblaster. Suksessen til denne metoden avhenger av optimal RNA transfection effektivitet av fibroblaster.
Og justering av pH-en til en transfection buffer er en viktig prosedyre for å oppnå dette. For å starte, klargjør transfection buffer ved hjelp av 500 milliliter og 100 milliliter romtemperatur forvarmede flasker med friske reduserte serum medium. Mål basen pH av mediet i 500 milliliter flaske ved å sette pH-målerens glasselektrode inn i bufferen, og vent opptil ett minutt før du leser pH.
For å justere pH, tilsett tre til fire milliliter av en molar natriumhydroksid i 500 milliliter flaske. Lukk flasken og bland godt. Etter å ha ventet i fem minutter, åpne flasken og sett pH-målerens elektrode inn i bufferen.
Vent til avlesningen på pH-måleren stabiliseres. Fortsett å legge til små volumer av en molarnatriumhydroksid til pH når 8,15 til 8,17, og sørg for å kalibrere pH-måleren flere ganger under prosessen. Bruk et vakuumfiltreringssystem på 0,22 mikrometer til å filtrere sterilisere transinfeksjonsbufferen.
Aliquot den steriliserte bufferen i fem milliliter rør med minimal luftplass. Kontroller at fibroblastene som skal omprogrammeres, er på 40 % til 60 %samløpet. Overfør fire milliliter DPBS til et konisk rør på 15 milliliter, og tilsett 100 mikroliter rekombinant humant laminin 521.
Bland godt ved å pipetter opp og ned. Tilsett en milliliter per brønn fortynnet rekombinant humant laminin 521 i tre brønner av en seks brønnplate. Inkuber denne belagte platen ved 37 grader celsius i to timer.
Under denne inkubasjonen, varm seks milliliter fibroblast ekspansjonsmedium og fire milliliter plating medium til 37 grader celsius. Supplere plating medium med grunnleggende FGF ved en endelig konsentrasjon på 100 nanograms per milliliter og B18R ved en endelig konsentrasjon på 200 nanogram per milliliter. Aspirer forsiktig det brukte mediet fra fibroblaster som er på 40% til 60% samløpet.
Skyll cellene med fem milliliter DPBS. Tilsett tre milliliter trypsin EDTA og klipp forsiktig platen for å dekke cellene med trypsin EDTA. Aspirer overflødig væske, la ca 500 mikroliter trypsin, og inkubere fibroblastene i tre minutter ved 37 grader celsius.
Etter å ha fjernet platen fra inkubatoren, trykker du bestemt, men forsiktig på siden av platen for å løsne cellene. Vis cellene under mikroskopet for å sjekke om de er løsrevet. Tilsett fem milliliter fibroblastekspansjonsmedium til de frittliggende cellene for å nøytralisere trypsin EDTA.
Samle cellene i en 15 milliliter konisk rør og bland dem godt. Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer, deretter pipette 12, 000 celler i fire milliliter av tidligere forberedt pre-oppvarmet plating medium. Etter å ha fjernet den belagte platen fra inkubatoren, aspirerer fortynnet laminin 521 fra brønnene, og sørger for at overflaten av brønnene ikke tørker.
Gjenoppus forsiktig cellene som er i platingmediet og tilsett en milliliter cellefjæring i hver belagt godt. Plasser de belagte cellene i en tri-gass vev kultur inkubator med lavt oksygen eller oksygen satt til 5%Og deretter forsiktig, men grundig spre cellene ved å veksle mellom en opp ned, deretter venstre høyre bevegelse, og gjenta bevegelsene to ganger, sørg for ikke å virvle platen. Inkuber cellene over natten.
I mellomtiden legger du til fire milliliter omprogrammeringsmedium til et konisk rør på 15 milliliter, og plasserer det i den lave O to inkubatoren med en løsnet hette for å likevekte over natten. Minst en time før transfection, fjerne likevekts omprogrammering medium fra en lav O to inkubator. Legg bFGF til en endelig konsentrasjon på 100 nanogram per milliliter, og B18R til en endelig konsentrasjon på 200 nanogram per milliliter, og bland godt.
Fungerer en brønn om gangen, bruk en en milliliter pipette for å fjerne det brukte mediet. Og erstatte den med en milliliter omprogrammering medium, supplert med bFGF og B18R. Flytt platen med celler tilbake i lav oksygen inkubatoren.
For å starte fibroblast transfection, først likevekt en aliquot av transfection buffer i ca en time ved romtemperatur. Fjern en enkelt 33 mikroliter aliquot av modifiserte MRNAs og 14 mikroliter aliquot av MIRNA etterligner fra negative 80 grader celsius, og varm dem til romtemperatur i ca tre til fem minutter til tint. Spinn dem ned kort i en mikrofuge.
Varm transfeksjonsreagensen til romtemperatur i ca. tre til fem minutter. Inverter røret to til tre ganger for å blande reagensen og spinne det ned kort i et mikrodrivstoff. Overfør 279 mikroliter av romtemperaturtransfeksjonsbufferen til et RNAs frie mikrocentrifugerør, og tilsett 31 mikroliter av transfection reagensen.
Bland godt ved å pipettere og inkubere ved romtemperatur i ett minutt. Tilsett 132 mikroliter av romtemperaturtransfeksjonsbufferen til 33 mikroliter aliquot av modifisert MRNA, og forsiktig pipette å blande. Tilsett 102,6 mikroliter av romtemperaturtransfeksjonsbufferen til 14 mikroliter aliquot av MIRNA etterligner og forsiktig pipette å blande.
For å forberede transfeksjonsblandingen av modifisert MRNA, tilsett 165 mikroliter av 310 mikroliter transfeksjonsbuffer, transfection reagensblanding til 165 mikroliter av transfeksjonsbufferen, modifisert MRNA-blanding. Pipette å blande. For å forberede transfection blandingen av MIRNA etterligner, tilsett 116,6 mikroliter av 310 mikroliter transfection buffer, transfection reagens blanding til 116,6 mikroliter transfection buffer, MIRNA etterligne blanding.
Bland godt og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur for å tillate transfection bufferen å komplekse med de modifiserte MRNAs og MIRNA etterligner. Fjern platen med celler fra inkubatoren med lavt oksygeninnhold. Slipp klokt over hver brønn, tilsett 100 mikroliter per brønn av transfeksjonsblandingen som inneholder de komplekse, modifiserte MRNAene.
Forsiktig, men grundig agitate platen med en opp ned, deretter venstre høyre bevegelse for å spre transfection komplekser. Tilsett 66,7 mikroliter per brønn av transfeksjonsblandingen som inneholder den komplekse MIRNA etterligner dråpevis over hver brønn. Forsiktig, men grundig agitate platen med en opp ned, deretter venstre høyre bevegelse for å spre transfection komplekser.
Plasser platen med de trans infiserte cellene i tri-gass inkubatoren med lavt oksygen. Spre transfection komplekser ved forsiktig, men grundig agitating platen med en opp ned, deretter venstre høyre bevegelse. Inkuber de trans infiserte cellene i inkubatoren i 16 til 20 timer før du endrer medium neste dag.
Tilsett fire milliliter omprogrammeringsmedium til et konisk rør på 15 milliliter, og legg det i den lave O to inkubatoren med en løsnet hette for å likevekte over natten. Neste morgen, erstatte transfection inneholder medium med frisk pre-likevektet medium supplert med bFGF og B18R og fortsette med transfection diett som beskrevet i protokollen. Etter vellykket plating inn i en brønn av en seks brønn format parabolen for omprogrammering, fibroblasts dukket svært sparsom.
24 timer etter den første vellykkede transfection, fibroblasts mistet sin spindel form og vedtatt en mer avrundet morfologi. Gjennom de tre første transfeksjonene økte celletettheten gradvis og konsekvent med et tilsynelatende utbrudd i spredning som oppsto mellom dag sju og åtte. Ved dag 10 dukket cellene i stor grad sammenføyd.
De første IPSC koloniene dukket opp så tidlig som dag 11. Ved dag 15 til 17 ble IPSC kolonier store og åpenbare og tydelig forskjellig fra omkringliggende og fullstendig omprogrammerte fibroblaster. Immunstaining for pluripotency markør TRA-1-60 bekreftet høy omprogrammering effektivitet.
Suboptimal plating tetthet er den vanligste årsaken til redusert effektivitet av omprogrammering i denne protokollen. Hvis plating tetthet var for lav, store acellulære baron patcher dukket opp og IPSC kolonier ikke danne. Etter fortynning passasje av omprogrammerte celler, IPSCs vokste som enkeltkolonier og var lett skilles fra fibroblaster.
De var løst pakket og individuelle celler hadde et relativt stort cytoplasmatisk område. I løpet av fire til syv dager spredte IPSCene seg og dannet en karakteristisk tettpakket koloni med definerte kanter. Individuelle celler i kolonien viste en stor kjernefysisk fraksjon med fremtredende nucleoli.
Etter omprogrammering av pasientfibroblaster kan de resulterende IPSC-ene differensieres til en rekke somatiske celler for å belyse sykdom som forårsaker mekanismer eller utvikle nye regenerative cellebaserte terapeutiske midler.
Her beskriver vi en klinisk relevant, høy effektivitet, mater-fri metode for å omprogrammere menneskelig primære fibroblaster i indusert pluripotent stilk celler med endrede mRNAs koding omprogrammering faktorer og moden microRNA-367/302 etterligner. Også inkludert er metoder for å vurdere omprogrammering effektivitet, utvide klonal iPSC koloniene, og Bekreft uttrykk for pluripotency markøren TRA-1-60.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved