9.9K Views
•
11:38 min
•
November 26th, 2018
DOI :
November 26th, 2018
•0:04
Title
0:45
Reagents Preparation
2:01
Plating Fibroblasts for Reprogramming: Day 0
5:09
Initiation of Reprogramming: Day 1
9:28
Results: Efficient Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into iPSCs
11:16
Conclusion
Transcript
På grund av sin höga effektivitet, denna metod kan ytterligare avancera inducerad pluripotenta stamceller, eller IPSCs som ett verktyg för att studera mänskliga sjukdomar och utveckla nya stamcellsterapier. Den största fördelen med detta protokoll är förmågan att generera högkvalitativa integration gratis IPSCs från primära mänskliga fibroblaster inklusive svårt att programmera om, sjukdom associerade, åldern, och senescent fibroblaster. Framgången för denna metod beror på optimal RNA transfektionseffektivitet av fibroblaster.
Och justera pH-värdet för en transfektionsbuffert är ett nyckelförfarande för att uppnå detta. För att starta, förbereda transfektionsbuffert med hjälp av 500 milliliter och 100 milliliter rumstemperatur förvjutna flaskor med färskt reducerat serummedium. Mät grundpH-värdet för mediet i 500 milliliterflaska genom att föra in pH-mätarens glaselektrod i bufferten, och vänta upp till en minut innan du läser pH-värdet.
För att justera pH,tillsätt tre till fyra milliliter av en molar natriumhydroxid i 500 milliliter flaska. Stäng flaskan och blanda väl. Efter att ha väntat i fem minuter öppnar du flaskan och för in pH-mätarens elektrod i bufferten.
Vänta tills avläsningen på pH-mätaren stabiliseras. Fortsätt att lägga till små volymer av en molar natriumhydroxid tills pH når 8,15 till 8,17, se till att kalibrera pH-mätaren flera gånger under processen. Använd ett 0,22 mikrometer vakuumfiltreringssystem för att filtrera sterilisera transfektionsbufferten.
Alikvoten den steriliserade bufferten i fem milliliterrör med minimalt luftutrymme. Kontrollera att fibroblaster som ska programmeras om är på 40%till 60%konfluency. Överför fyra milliliter DPBS till ett koniskt rör på 15 milliliter och tillsätt 100 mikroliter rekombinanta humana laminin 521.
Blanda noggrant genom att pipettera upp och ner. Tillsätt en milliliter per brunn av utspädd rekombinant mänsklig laminin 521 i tre brunnar av en sex brunnsplatta. Inkubera denna belagda platta vid 37 grader celsius i två timmar.
Under denna inkubation, varma sex milliliter fibroblast expansionsmedium och fyra milliliter av plätering medium till 37 grader celsius. Komplettera pläteringsmediet med grundläggande FGF vid en slutkoncentration på 100 nanogram per milliliter och B18R vid en slutkoncentration på 200 nanogram per milliliter. Försiktigt aspirera det förbrukade mediet från fibroblaster som är på 40%till 60%konfluency.
Skölj cellerna med fem milliliter DPBS. Tillsätt tre milliliter trypsin EDTA och försiktigt klippa plattan för att täcka cellerna med trypsin EDTA. Aspirera överflödig vätska, lämnar cirka 500 mikroliter trypsin, och inkubera fibroblaster i tre minuter vid 37 grader celsius.
Efter att ha tagit bort plattan från inkubatorn, fast men försiktigt knacka sidan av plattan för att rubba cellerna. Visa cellerna under mikroskopet för att kontrollera om de har lossnat. Tillsätt fem milliliter fibroblast expansionsmedium till de fristående cellerna för att neutralisera trypsin EDTA.
Samla in cellerna i en 15 milliliter koniska röret och blanda dem väl. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer, sedan pipettera 12, 000 celler i fyra milliliter av tidigare beredda förvättnad plätering medium. Efter att ha tagit bort den belagda plattan från inkubatorn, aspirera utspädd laminin 521 från brunnarna, se till att ytan av brunnarna inte torkar.
Försiktigt återanvända de celler som är i pläteringsmediet och tillsätt en milliliter cell suspension i varje belagd brunn. Placera de pläterade cellerna i en tri-gas vävnad kultur inkubator med låg syrehalt eller syre inställd på 5%Och sedan försiktigt men grundligt skingra cellerna genom att växla mellan en upp ner, sedan vänster höger rörelse, och upprepa rörelser två gånger, se till att inte snurra plattan. Inkubera cellerna över natten.
Under tiden, tillsätt fyra milliliter omprogrammering medium till en 15 milliliter koniska röret, och placera den i den låga O två inkubator med en lossad mössa för att balansera över natten. Minst en timme före transfection, ta bort det ekvilibrerade omprogrammeringsmedium från en låg O två inkubator. Lägg till bFGF till en slutlig koncentration av 100 nanogram per milliliter, och B18R till en slutlig koncentration av 200 nanogram per milliliter, och blanda väl.
Arbeta en bra i taget, använd en milliliter pipett för att ta bort det förbrukade mediet. Och ersätta den med en milliliter av omprogrammering medium, kompletterat med bFGF och B18R. Flytta plattan med celler tillbaka in i låg syre inkubator.
För att starta fibroblast transfection, först jämvikt en alikvot av transfektionsbufferten i ungefär en timme vid rumstemperatur. Ta bort en enda 33 microliter alikvot av modifierade MRNAs och 14 microliter alikvot av MIRNA härmar från negativa 80 grader celsius, och värm dem till rumstemperatur i cirka tre till fem minuter tills tinas. Snurra ner dem kort i en mikrofuge.
Värm transfektionsreagensen till rumstemperatur i cirka tre till fem minuter. Invertera röret två till tre gånger för att blanda reagensen och snurra ner det kort i en mikrofuge. Överför 279 mikroliter av rumstemperaturtransfektionsbufferten till ett RNAs fritt mikrocentrifugrör, och tillsätt 31 mikroliter av transfektionsreagensen.
Blanda noggrant genom pipettering och inkubera i rumstemperatur i en minut. Tillsätt 132 mikroliter av rumstemperaturen transfection buffert till 33 microliter alikvot av modifierade MRNA, och försiktigt pipetter att blanda. Tillsätt 102,6 mikroliter av rumstemperaturen transfektion buffert till 14 microliter alikvoten av MIRNA härmar och försiktigt pipetter att blanda.
För att förbereda transfektionsmixen av modifierad MRNA, tillsätt 165 mikroliter av 310 mikroliters transfection buffert, transfektionsreagensblandning till 165 mikroliter av transfektionsbufferten, modifierad MRNA-mix. Pipett att blanda. För att förbereda transfektion mix av MIRNA härmar, tillsätt 116,6 mikroliter av 310 microliter transfection buffert, transfektion reagens mix till 116,6 mikroliter transfection buffert, MIRNA härma mix.
Blanda väl och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur så att transfektionsbufferten kan komplexas med de modifierade MRNAs och MIRNA härmar. Ta bort plattan med celler från inkubatorn med låg syrgashalt. Släpp klokt över varje brunn, tillsätt 100 mikroliter per brunn av transfektionsmixen som innehåller de komplexa, modifierade MRNAs.
Försiktigt men grundligt agitera plattan med en upp ner, sedan vänster höger rörelse för att skingra transfektionskomplex. Lägg till 66,7 mikroliter per brunn av transfektionsmixen som innehåller den komplexa MIRNA härmar drop wise över varje brunn. Försiktigt men grundligt agitera plattan med en upp ner, sedan vänster höger rörelse för att skingra transfektionskomplex.
Placera plattan med de transfekterade cellerna i tri-gasinkubatorn med lågt syre. Skingra transfektionskomplexen genom att försiktigt men grundligt uppröra plattan med en upp neråt, sedan vänster höger rörelse. Inkubera de transfekterade cellerna i inkubatorn i 16 till 20 timmar innan du byter medium följande dag.
Tillsätt fyra milliliter omprogrammering medium till en 15 milliliter koniska rör, och placera den i den låga O två inkubatorn med en lossad mössa för att balansera över natten. Följande morgon, ersätta transfection som innehåller medium med färska pre-equilibrated medium kompletteras med bFGF och B18R och fortsätta med transfection regimen som beskrivs i protokollet. Efter framgångsrika plätering i en brunn av en sex väl format maträtt för omprogrammering, fibroblaster verkade mycket gles.
24 timmar efter den första framgångsrika transfection, fibroblaster förlorat sin spindel form och antog en mer rundad morfologi. Under de första tre transfections ökade celltätheten gradvis och konsekvent med en uppenbar bristning i spridning inträffar mellan dag sju och åtta. Vid dag 10, cellerna verkade i stort sett konfluent.
De första IPSC-kolonierna dök upp så tidigt som dag 11. Vid dag 15 till 17, IPSC kolonier blev stora och uppenbara och tydligt skild från omgivande och helt omprogrammerade fibroblaster. Immunostaining för pluripotency markörEN TRA-1-60 bekräftade hög omprogrammering effektivitet.
Suboptimal plätering densitet är den vanligaste orsaken till minskad effektivitet av omprogrammering i detta protokoll. Om plätering densitet var för låg, stora acellulära baron fläckar dök upp och IPSC kolonier inte bildas. Efter utspädning passage av omprogrammerade celler, IPSCs växte som enda kolonier och var lätt skiljas från fibroblaster.
De var löst packade och enskilda celler hade ett relativt stort cytoplasmatiskt område. Under fyra till sju dagar spreds IPSCs och bildade en karakteristisk tätt packad koloni med definierade kanter. Enskilda celler inom kolonin visade en stor nukleär fraktion med framstående nukleolerna.
Efter omprogrammering patient fibroblaster, kan den resulterande IPSCs differentieras till en mängd olika somatiska celler i syfte att klarlägga sjukdomar som orsakar mekanismer eller utveckla nya regenerativ cell-baserade therapeutics.
Här beskriver vi en kliniskt relevant, hög verkningsgrad, feeder-fri metod att omprogrammera humana primära fibroblaster till inducerade pluripotenta stamceller använder modifierade mRNA kodning omplanering faktorer och mogen mikroRNA-367/302 härmar. Här ingår också metoder för att bedöma omplanering effektivitet, expandera klonal iPSC kolonier och bekräfta uttryck för pluripotens markören TRA-1-60.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved