Name: evaluation of the interplay between the complement protein c1q and hyaluronic acid in promoting cell adhesion
Uploaded: 2019-06-15T13:00:00
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Nous remercions Ivan Donati pour la fourniture de HA, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (Département de gynécologie de l'IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italie) et Andrea Romano (Unité Clinique Opérationnelle d'Anatomie et d'Histologie Pathologique, Hôpital Cattinara, Trieste, Italie ) pour la collecte d'échantillons de tissus. Nous remercions également Nicolo Morosini pour l'aide dans la préparation vidéo et Alex Coppola, la voix. Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut pour la santé maternelle et infantile, IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italie (RC20/16) et Fondazione Cassa di Risparmio Trieste à R.Bulla.

Des échantillons de tissus prélevés sur des patients ont été prélevés après consentement éclairé à la suite de l'approbation des considérations éthiques par le conseil institutionnel de l'hôpital universitaire de Trieste, en Italie.
1. Isolement et culture des cellules tumorales (Jour 1)
<ol><li>Isoler les cellules du mésothéliome humain à partir de spécimens solides MPM. Hacher finement le tissu à l'aide d'un cutter pour obtenir des fragments d'environ 2-3 mm2 ...

<ol>
	<li>Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+hyaluronic+acid+in+immunoprotection+and+immunomodulation:+Chemistry,+processing+and+function.">The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function.</a> Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).</li><li>Lorusso, G., Ruegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis.">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li><li>Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement:+a+key+system+for+immune+surveillance+and+homeostasis.">Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis.</a> Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).</li><li>Bulla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1q+acts+in+the+tumour+microenvironment+as+a+cancer-promoting+factor+independently+of+complement+activation.">C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation.</a> Nature Communications. 7, 10346 (2016).</li><li>Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+stromal+gene+signatures+in+breast+cancer.">Prognostic stromal gene signatures in breast cancer.</a> Breast Cancer Research. 17, 23 (2015).</li><li>Collins, M. N., Birkinshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+solutions:+A+processing+method+for+efficient+chemical+modification.">Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification.</a> Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).</li><li>Itano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+primary+structure,+complex+turnover+regulation+and+multiple+roles+of+hyaluronan.">Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan.</a> Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).</li><li>Agostinis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+role+of+C1q+in+cell+migration+and+tissue+remodeling:+contribution+to+trophoblast+invasion+and+placental+development.">An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development.</a> Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).</li><li>Agostinis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+Protein+C1q+Binds+to+Hyaluronic+Acid+in+the+Malignant+Pleural+Mesothelioma+Microenvironment+and+Promotes+Tumor+Growth.">Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1559 (2017).</li><li>Bossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1q+as+a+unique+player+in+angiogenesis+with+therapeutic+implication+in+wound+healing.">C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).</li><li>Hosszu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+expression+and+function+of+the+macromolecular+c1+complex+on+the+surface+of+human+monocytes.">Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 38 (2012).</li><li>Laurent, T. C., Fraser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan.">Hyaluronan.</a> Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).</li><li>Gaboriaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+globular+head+of+complement+protein+C1q+provides+a+basis+for+its+versatile+recognition+properties.">The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).</li><li>Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+cell-matrix+interactions+in+hyaluronic+acid+hydrogel+scaffolds.">Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).</li></ol>

Nous décrivons une méthode facile pour étudier comment le composant de complément C1q, interagissant avec l'acide hyaluronique, est capable de moduler le comportement des cellules primaires isolées des tissus tumoraux humains. Les deux HA et C1q sont abondamment présents dans le microenvironnement tissulaire à la fois dans des conditions physiologiques et pathologiques, participant à plusieurs processus biologiques cellulaires. Par exemple, C1q a été montré pour être présent dans le microenvironnement du pla...

Le microenvironnement de tumeur (TME) influence le développement et la progression de cancer puisqu'il peut fournir une niche permissive pour la survie, la croissance et l'invasion cellulaires. L'identification de nouveaux acteurs clés dans le TME peut être utile pour la découverte de nouveaux outils moléculaires pour la thérapie ciblée. TME comprend un réseau complexe et dynamique de cellules non malignes, telles que les cellules endothéliales, les fibroblastes et les cellules du système immunitaire, intégrées dans les composants de la matrice extracellulaire environnante (ECM), y compris les collagènes, les laminins, les fibronectines, protéoglycanes et hyaluronans. Les cellules tumorales et non tumorales synthétisent et sécrètent des composants ECM ainsi que des cytokines, des chimiokines, des facteurs de croissance et des enzymes inflammatoires et matricielles qui modifient globalement les propriétés physiques, chimiques et de signalisation du TME. Parmi ces constituants, l'acide hyaluronique (HA) a émergé pour exercer un rôle crucial dans la biologie de tumeur. Malgré sa composition chimique simple, HA, avec ses molécules HA-contraignantes (hyaladherins), peut moduler l'angiogenèse, la réactivité du système immunitaire et eCM remodelage d'une manière dépendante de la taille et la concentration1.
Le système de complément (C) fait également partie du TME local, qui a récemment reçu une attention croissante. Le système C englobe un ensemble de protéines solubles et liées à la membrane impliquées dans la première ligne de défense contre les non-autocellules, les éléments hôtes indésirables et les agents pathogènes. Fonctionnellement, le C relie les bras à deux effecteurs des systèmes innés et adaptatifs pour favoriser soit l'abattage direct des cellules, soit le montage d'une réponse inflammatoire2. L'activation de C peut supprimer la croissance de tumeur, en détruisant des cellules cancéreuses ou en inhibant leur excroissance, mais il est devenu de plus en plus clair qu'elle peut posséder une activité de tumeur-promotion en soutenant l'inflammation chronique, favorisant l'établissement d'un milieu immunosuppresseur, induisant l'angiogenèse, et activant les voies de signalisation liées au cancer3. Dans ce contexte, C1q, la première molécule de reconnaissance de la voie classique du système C a émergé pour exercer des fonctions importantes dans le microenvironnement tumoral indépendamment de l'activation C4. C1q a été montré pour être exprimé localement par une gamme de tumeurs malignes humaines, où il peut favoriser l'adhérencede cellules cancéreuses, la migration et la prolifération en plus de l'angiogenèse et la métase 5. Il est intéressant de noter que le C1q interagit avec un constituant important de l'ECM comme l'HA.
Nous avons développé une technique pour isoler les cellules cancéreuses primaires de la masse tumorale. En outre, nous avons créé la matrice, qui peut stimuler le microenvironnement de tumeur, particulièrement l'interaction entre C1q et acide hyaluronique de poids moléculaire élevé. C1q lié à HA a été en mesure d'induire l'adhérence des cellules tumorales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1447px;" width="1445">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">100&#8201;&#181;m pore filter</td>
			<td style="width:311px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:131px;">352360</td>
			<td style="width:676px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Amphotericin B solution (fungizone)</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">basic FGF</td>
			<td style="width:311px;">Immunological Sciences</td>
			<td style="width:131px;">GRF-15595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">C-4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase type I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation, DBA</td>
			<td style="width:131px;">MX1D12644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Roche</td>
			<td style="width:131px;">10 104 159 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">EDTA</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:330px;">EGF</td>
			<td style="width:311px;">Immunological Sciences</td>
			<td style="width:131px;">GRF-10544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:330px;">FAST DiI</td>
			<td style="width:311px;">Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">D7756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:311px;">Gibco,&#160; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:311px;">Roche</td>
			<td style="width:131px;">11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Flask for cell culture</td>
			<td style="width:311px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">430639</td>
			<td>Sterile, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Gentamicin solution</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">G1397-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBBS)&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">H6648</td>
			<td>Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">High molecular weight hyaluronic acid</td>
			<td style="width:311px;">Kind gift by Prof. Ivan Donati</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Human endothelial serum free medium&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Gibco,&#160; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">11111-044</td>
			<td>Supplemented with EGF (5&#8201;ng/mL), basic FGF (10&#8201;ng/mL), and&#160; 1% penicillin&#8211;streptomycin (Sigma-Aldrich)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:311px;">Carlo Erba</td>
			<td style="width:131px;">13446-18-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medium 199 with Hank&#8217;s salt</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">M7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:330px;">Time-lapse microscopy&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Imaging System BioStation IM-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Titertek Multiskan ELISA Reader</td>
			<td>Flow Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">T4674</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the interplay between the complement protein c1q and hyaluronic acid in promoting cell adhesion

Il a été de plus en plus démontré que le microenvironnement de tumeur joue un rôle actif dans la croissance et la métasse de néoplasia. Par différentes voies, les cellules tumorales peuvent recruter efficacement des cellules stromales, immunitaires et endothéliales en sécrétant des facteurs stimulants, des chimiokines et des cytokines. À leur tour, ces cellules peuvent modifier les propriétés de signalisation du microenvironnement en libérant des signaux favorisant la croissance, des métabolites et des composants de matrice extracellulaire pour soutenir une forte prolifération et la compétence métastatique. Dans ce contexte, nous identifions que le composant complémentaire C1q, fortement exprimé localement par une gamme de tumeurs malignes humaines, en interagissant avec l'acide hyaluronique de matrice extracellulaire, affecte fortement le comportement des cellules primaires isolées de la tumeur humaine Spécimens. Ici, nous décrivons une méthode pour tester comment C1q lié à l'acide hyaluronique (HA) affecte l'adhérence de cellules de tumeur, sous-jacente au fait que les propriétés biologiques des composants principaux de la matrice extracellulaire (dans ce cas HA) peuvent être façonnées par des signaux bioactifs vers la tumeur progression.

L'HA est un polysaccharide à poids moléculaire élevé chargé négativement, qui est composé de répéter (1-4) -Acide glucuronique-(1-3)-N-acétyl-D-glucosamine unités de disaccharide (figure 1B)7. L'occurrence de la liaison de L'HA sur la plaque de 96 puits ainsi que l'efficacité de son immobilisation ont été testées en tirant parti de l'HA biotinylated (bio-HA). Différentes concentrations de Bio-HA, allant de 10 g/mL à 1 ...

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Evaluation of the Interplay Between the Complement Protein C1q and Hyaluronic Acid in Promoting Cell Adhesion

Le composant de complément C1q est une molécule pro-inflammatoire fortement exprimée dans le microenvironnement de tissu qui peut interagir avec la matrice extracellulaire. Ici, nous décrivons une méthode pour tester comment C1q lié à l'acide hyaluronique affecte l'adhérence cellulaire.

Évaluation de l'interaction entre le complément protéique C1q et l'acide hyaluronique dans la promotion de l'adhérence cellulaire

It has been increasingly demonstrated that the tumor microenvironment plays an active role in neoplasia growth and metastasis. Through different pathways, ...

Une procédure complète pour évaluer l’interaction entre la protéine complémentaire C1q et l’acide hyaluronique dans la promotion de l’adhérence cellulaire. Nous avons récemment défini que le composant de complément C1q une molécule du système immunitaire inné est fortement exprimée dans le microenvironnement de tumeur et de placenta et est capable d’interagir avec la composante de la matrice extracellulaire. Dans ce cas, l’acide hyaluronique.Nous proposons une méthode pour étudier les fonctions biologiques des protéines dans tout l’environnement écronomic. Afin d’étudier la capacité de ces molécules à façonner les propriétés de division cellulaire des facteurs de matrice extracellulaire. Afin d’étudier comment cette interaction peut être détectée par les cellules présentes dans le tissu de l’environnement, nous avons mis en place cette méthode facile dans laquelle les cellules binaires dérivées des tissus humains ont été autorisés à adhérer à C1q lié à la matrice extracellulaire, dans ce cas l’acide hyaluronique.Pour la procédure de revêtement, la première étape est la liaison de l’acide hyaluronique de poids moléculaire élevé à 96 microplaques enduites de tissu bien. Pour le revêtement, l’acide hyaluronique est dilué dans 0,1 tampon de carbone taupe PH 9,6 à une concentration de 15 microgrammes par millilitre. Et le pipeting doucement est requited pour réaliser une solution homogène.Une 100 microlitres de la solution sont utilisés pour enrober les puits. La plaque est ensuite transférée à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, aspirez les puits traités.Laver une fois avec dPBS. Ajouter c1q ou BSA dans les puits correspondants. C1q est aujourd’hui disponible dans le commerce à une concentration d’un milligramme par millilitre et il est dilué à une concentration de 25 microgrammes par millilitre.Et dPBS contenant 0,5%BSA et 0,7 millimoles calcium et magnésium et cations divalent. BSA LPS libre est utilisé à la concentration de 0,5% et la date PBF. La plaque est ensuite transférée à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Les interactions dépendantes de la dose C1q avec l’acide hyaluronique immobilisé sont déterminées par immuno SA lié à l’enzyme. Étiquetage des cellules avec dii rapide. Le traceur lipophile rapide DiI est utilisé pour étiqueter les cellules d’intérêt. Les cellules résusées dans le DPBS sont utilisées à la concentration d’un million de cellules par millilitre.Fast DiI est dilué de un à 100 directement dans la suspension cellulaire. La suspension cellulaire est mélangée manuellement et transférée à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après cinq minutes d’incubation, mélanger la suspension cellulaire et répéter cette opération deux fois de plus.Pour éliminer l’excès de DiI rapide, ajouter 10 millilitres de dPBS. Pivotez doucement de haut en bas et centrifugez à 250 g pendant sept minutes. Resuspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu sans sérum endophilique humain en présence de 0,1%BSA.Adhérence des cellules sur l’acide hyaluronique C1q matrices. Aspirer sous vide le dPBS des puits enduits. Distribuez 100 microlitres de suspension cellulaire étiquetée aux puits enduits.200 microlitres de cellules étiquetées sont démontés dans un tube d’épendure pour être utilisés pour la génération standard de courbes. Incuber la plaque pendant 35 minutes à 37 degrés Celsius. Sortez la plaque de l’incubateur.Aspirez doucement les cellules déséquilibrées. Lavez-le une fois avec du dPBS contenant 0,5 % de BSA et 0,7 millimoles de calcium et de magnésium. Lys les cellules adhérentes en ajoutant 200 microlitres de tampon de lyse.Dans le même temps préparer la courbe standard sur une à deux dilution en série des cellules étiquetées dans le tampon de lyse. Effectuez la lecture du signal de florescence à l’instrument infini F 200 T-can à l’aide de 544 nanomètres comme longueur d’onde d’excitation et de 590 nanomètres comme longueur d’onde d’émission. Résultats représentatifs.Comme le montrent les résultats représentatifs, il est évident que l’adhérence cellulaire à l’acide hyaluronique a trouvé C1q aussi fortement amélioré par rapport à ha seul ou HA lié BSA. Le pourcentage de cellules adhérentes sur chaque matrice est calculé sur la base de la courbe standard. Conclusions. Dans nos expériences tout d’abord, nous avons évalué la capacité du composant de complément C12 à lier la matrice extracellulaire dans ce cas l’acide hyaluronique à l’aide d’un métal arisal.Deuxièmement, nous avons analysé la capacité des cellules primaires humaines tachées de colorant fluorescent à poursuivre l’acide hyaluronique lié. Le modèle que nous avons proposé dans cette étude est une méthode plus rapide et moins chère en alternative au modèle 3D des échafaudages extracellulaires de matrice pour l’évaluation sur cette réponse cellulaire à une combinaison de stimulus.

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