Name: evaluation of the interplay between the complement protein c1q and hyaluronic acid in promoting cell adhesion
Uploaded: 2019-06-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Interplay Between the Complement Protein C1q and Hyaluronic Acid in Promoting Cell Adhesion at JoVE.com

Wir danken Ivan Donati für die Bereitstellung von HA, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (Abteilung für Gynäkologie der IRCCS "Burlo Garofolo", Triest, Italien) und Andrea Romano (Operative Klinische Abteilung für Anatomie und pathologische Histologie, Cattinara Krankenhaus, Triest, Italien ) für die Gewebeprobenentnahme. Wir danken auch Nicolé Morosini für die Hilfe bei der Videovorbereitung und Alex Coppola, der Stimme. Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Instituts für Mütter- und Kindergesundheit, IRCCS "Burlo Garofolo", Triest, Italien (RC20/16) und Fondazione Cassa di Risparmio Trieste an R.Bulla unterstützt.

Gewebeproben von Patienten wurden nach Zustimmung der Informierten nach Genehmigung der ethischen Erwägungen durch das Institutional Board des Universitätsklinikums Triest, Italien, entnommen.
1. Tumorzellisolierung und -kultur (Tag 1)
<ol><li>Isolieren Sie menschliche Mesotheliomzellen aus mPM-Festkörperproben. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Fräser fein hacken, um Fragmente von ca. 2-3 mm2 in der Größe zu erhalten und in 5 ml Verdauungslösung zu brüten, bestehend aus ...

<ol>
	<li>Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+hyaluronic+acid+in+immunoprotection+and+immunomodulation:+Chemistry,+processing+and+function.">The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function.</a> Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).</li><li>Lorusso, G., Ruegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis.">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li><li>Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement:+a+key+system+for+immune+surveillance+and+homeostasis.">Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis.</a> Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).</li><li>Bulla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1q+acts+in+the+tumour+microenvironment+as+a+cancer-promoting+factor+independently+of+complement+activation.">C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation.</a> Nature Communications. 7, 10346 (2016).</li><li>Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+stromal+gene+signatures+in+breast+cancer.">Prognostic stromal gene signatures in breast cancer.</a> Breast Cancer Research. 17, 23 (2015).</li><li>Collins, M. N., Birkinshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+solutions:+A+processing+method+for+efficient+chemical+modification.">Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification.</a> Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).</li><li>Itano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+primary+structure,+complex+turnover+regulation+and+multiple+roles+of+hyaluronan.">Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan.</a> Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).</li><li>Agostinis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+role+of+C1q+in+cell+migration+and+tissue+remodeling:+contribution+to+trophoblast+invasion+and+placental+development.">An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development.</a> Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).</li><li>Agostinis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+Protein+C1q+Binds+to+Hyaluronic+Acid+in+the+Malignant+Pleural+Mesothelioma+Microenvironment+and+Promotes+Tumor+Growth.">Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1559 (2017).</li><li>Bossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1q+as+a+unique+player+in+angiogenesis+with+therapeutic+implication+in+wound+healing.">C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).</li><li>Hosszu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+expression+and+function+of+the+macromolecular+c1+complex+on+the+surface+of+human+monocytes.">Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 38 (2012).</li><li>Laurent, T. C., Fraser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan.">Hyaluronan.</a> Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).</li><li>Gaboriaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+globular+head+of+complement+protein+C1q+provides+a+basis+for+its+versatile+recognition+properties.">The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).</li><li>Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+cell-matrix+interactions+in+hyaluronic+acid+hydrogel+scaffolds.">Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).</li></ol>

Wir beschreiben eine einfache Methode, um zu untersuchen, wie die Komplementkomponente C1q, die mit Hyaluronsäure interagiert, in der Lage ist, das Verhalten von Primärzellen zu modulieren, die aus menschlichen Tumorgeweben isoliert sind. Sowohl HA als auch C1q sind sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen reichlich in der Gewebemikroumgebung vorhanden und nehmen an mehreren zellbiologischen Prozessen teil. Zum Beispiel, C1q hat sich gezeigt, in der Mikroumgebung der Plazenta vorhanden zu ...

Die Tumormikroumgebung (TME) beeinflusst die Entwicklung und Progression von Krebs, da sie eine freizügige Nische für Zellüberleben, Wachstum und Invasion bieten kann. Die Identifizierung neuer Schlüsselakteure in TME kann für die Entdeckung neuer molekularer Werkzeuge für die Zieltherapie nützlich sein. TME umfasst ein komplexes und dynamisches Netzwerk von nicht-bösartigen Zellen, wie Endothelzellen, Fibroblasten und Zellen des Immunsystems, eingebettet in die umgebenden extrazellulären Matrixkomponenten (ECM) einschließlich Kollagene, Laminine, Fibronectine, Proteoglykane und Hyaluronane. Sowohl Tumor- als auch Nicht-Tumorzellen synthetisieren und sezernieren ECM-Komponenten zusammen mit Zytokinen, Chemokinen, Wachstumsfaktoren und entzündlichen und Matrix-Remodeling-Enzymen, die insgesamt die physikalischen, chemischen und signalischen Eigenschaften von TME verändern. Unter diesen Bestandteilen, Hyaluronsäure (HA) hat sich herausgebildet, um eine entscheidende Rolle in der Tumorbiologie zu üben. Trotz seiner einfachen chemischen Zusammensetzung kann HA zusammen mit seinen HA-bindenden Molekülen (Hyaladherinen) Angiogenese, Reaktionsfähigkeit des Immunsystems und ECM-Umbau in einer größen- und konzentrationsabhängigen Weise modulieren1.
Das Komplementsystem (C) ist auch Teil der lokalen TME, die in letzter Zeit zunehmend Beachtung gefunden hat. Das C-System umfasst eine Reihe von löslichen und membrangebundenen Proteinen, die an der ersten Verteidigungslinie gegen Nicht-Selbstzellen, unerwünschte Wirtselemente und Krankheitserreger beteiligt sind. Funktionell verbindet das C die Zweieffekterarme angeborener und adaptiver Systeme, um entweder die direkte Zelltötung oder die Montage einer Entzündungsreaktion zu fördern2. C-Aktivierung kann Tumorwachstum unterdrücken, indem krebsartige Zellen zerstört oder ihr Auswuchs hemmt, aber es ist immer klarer geworden, dass es eine tumorfördernde Aktivität besitzen kann, indem es chronische Entzündungen aufrechterhält und die Etablierung eines immunsuppressives Milieu, die Angiogenese induzieren und krebsbedingte Signalwege aktivieren3. In diesem Zusammenhang hat sich C1q, das erste Erkennungsmolekül des klassischen Signalwegs des C-Systems, herausgebildet, um wichtige Funktionen in der Tumormikroumgebung unabhängig von c-Aktivierung4auszuüben. C1q hat sich gezeigt, lokal durch eine Reihe von menschlichen bösartigen Tumoren ausgedrückt werden, wo es Krebszelladhäsion, Migration und Proliferation zusätzlich zu Angiogenese und Metastasierung5bevorzugen kann. Interessanterweise interagiert C1q mit einem hauptbestandteil des ECM wie HA.
Wir entwickelten eine Technik, um die primären Krebszellen von der Tumormasse zu isolieren. Darüber hinaus haben wir die Matrix entwickelt, die die Tumormikroumgebung stimulieren kann, insbesondere die Wechselwirkung zwischen C1q und hochmolekularer Hyaluronsäure. C1q gebunden an HA war in der Lage, Adhäsion der Tumorzellen zu induzieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1447px;" width="1445">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">100&#8201;&#181;m pore filter</td>
			<td style="width:311px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:131px;">352360</td>
			<td style="width:676px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Amphotericin B solution (fungizone)</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">basic FGF</td>
			<td style="width:311px;">Immunological Sciences</td>
			<td style="width:131px;">GRF-15595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">C-4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase type I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation, DBA</td>
			<td style="width:131px;">MX1D12644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Roche</td>
			<td style="width:131px;">10 104 159 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">EDTA</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:330px;">EGF</td>
			<td style="width:311px;">Immunological Sciences</td>
			<td style="width:131px;">GRF-10544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:330px;">FAST DiI</td>
			<td style="width:311px;">Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">D7756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:311px;">Gibco,&#160; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:311px;">Roche</td>
			<td style="width:131px;">11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Flask for cell culture</td>
			<td style="width:311px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">430639</td>
			<td>Sterile, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Gentamicin solution</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">G1397-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBBS)&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">H6648</td>
			<td>Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">High molecular weight hyaluronic acid</td>
			<td style="width:311px;">Kind gift by Prof. Ivan Donati</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Human endothelial serum free medium&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Gibco,&#160; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">11111-044</td>
			<td>Supplemented with EGF (5&#8201;ng/mL), basic FGF (10&#8201;ng/mL), and&#160; 1% penicillin&#8211;streptomycin (Sigma-Aldrich)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:311px;">Carlo Erba</td>
			<td style="width:131px;">13446-18-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medium 199 with Hank&#8217;s salt</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">M7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:330px;">Time-lapse microscopy&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Imaging System BioStation IM-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Titertek Multiskan ELISA Reader</td>
			<td>Flow Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">T4674</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the interplay between the complement protein c1q and hyaluronic acid in promoting cell adhesion

Es wurde zunehmend gezeigt, dass die Tumormikroumgebung eine aktive Rolle bei Neoplasiewachstum und Metastasen spielt. Durch verschiedene Wege können Tumorzellen stromale, Immun- und Endothelzellen effizient rekrutieren, indem sie stimulierende Faktoren, Chemokine und Zytokine sezernieren. Im Gegenzug können diese Zellen die Signaleigenschaften der Mikroumgebung verändern, indem sie wachstumsfördernde Signale, Metaboliten und extrazelluläre Matrixkomponenten freisetzen, um eine hohe Proliferation und metastasierende Kompetenz aufrechtzuerhalten. In diesem Zusammenhang identifizieren wir, dass die Komplementkomponente C1q, die lokal durch eine Reihe von menschlichen bösartigen Tumoren stark exprimiert wird, wenn sie mit der extrazellulären Matrix Hyaluronsäure interagiert, das Verhalten von Primärzellen stark beeinflusst, die aus dem menschlichen Tumor isoliert sind. Exemplare. Hier beschreiben wir eine Methode, um zu testen, wie C1q, das an Hyaluronsäure (HA) gebunden ist, die Adhäsion von Tumorzellen beeinflusst, was der Tatsache zugrunde liegt, dass die biologischen Eigenschaften der Wichtigsten komponenten der extrazellulären Matrix (in diesem Fall HA) durch bioaktive Signale in Richtung Tumor geformt werden können. Fortschreiten.

HA ist ein negativ geladenes hochmolekulares Polysaccharid, das aus sich wiederholenden (1-4)-D-Glucuronsäure-(1-3)-N-Acetyl-D-Glucosamindisaccharid-Einheiten besteht (Abbildung 1B)7. Das Auftreten der Bindung von HA auf der 96-Well-Platte sowie die Effizienz ihrer Immobilisierung wurden unter Ausnutzung von biotinyliertem HA (bio-HA) getestet. Verschiedene Konzentrationen von Bio-HA, die von 10 g/ml bis 1 mg/ml reichten, wurden in 10...

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Evaluation of the Interplay Between the Complement Protein C1q and Hyaluronic Acid in Promoting Cell Adhesion

Die Komplementkomponente C1q ist ein in der Gewebemikroumgebung hochgradig exprimiertes pro-inflammatorisches Molekül, das mit der extrazellulären Matrix interagieren kann. Hier beschreiben wir eine Methode, um zu testen, wie C1q, das an Hyaluronsäure gebunden ist, die Zellhaftung beeinflusst.

Bewertung des Zusammenspiels zwischen dem Komplementprotein C1q und Hyaluronsäure bei der Förderung der Zelladhäsion

It has been increasingly demonstrated that the tumor microenvironment plays an active role in neoplasia growth and metastasis. Through different pathways, ...

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung des Zusammenspiels zwischen dem Komplementprotein C1q und Hyaluronsäure bei der Förderung der Zelladhäsion. Wir haben vor kurzem definiert, dass die Komplementkomponente C1q ein Molekül des angeborenen Immunsystems stark im Tumor und Plazenta Mikroumgebung exprimiert ist und in der Lage ist, mit Einer komponente der extrazellulären Matrix zu interagieren. In diesem Fall Hyaluronsäure.Wir schlagen eine Methode zur Untersuchung der biologischen Funktionen von Proteinen in der gesamten ekronomischen Umgebung vor. Um die Fähigkeit dieser Moleküle zu untersuchen, die Zellteilungseigenschaften von extrazellulären Matrixfaktoren zu formen. Um zu untersuchen, wie diese Wechselwirkung von den Zellen im Gewebe der Umwelt wahrgenommen werden kann, haben wir diese einfache Methode eingerichtet, bei der binäre Zellen aus menschlichen Geweben an C1q haften durften, die an die extrazelluläre Matrix gebunden sind, in diesem Fall Hyaluronsäure.Für das Beschichtungsverfahren ist der erste Schritt die Bindung von hochmolekularer Hyaluronsäure an 96 gut gewebebeschichtete Mikroplatten. Für die Beschichtung wird Hyaluronsäure in 0,1 Mol Kohlenstoffpuffer PH 9.6 in einer Konzentration von 15 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt. Und sanftes Pfeifen wird erwidert, um eine homogene Lösung zu erreichen.Zur Beschichtung der Brunnen werden 100 Mikroliter der Lösung verwendet. Die Platte wird dann bei vier Grad Celsius über Nacht übertragen. Am nächsten Tag Vakuum aspirieren die behandelten Brunnen.Einmal mit dPBS waschen. Fügen Sie entweder C1q oder BSA in die entsprechenden Bohrungen. C1q ist heute in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter kommerziell erhältlich und wird in einer Konzentration von 25 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt.Und dPBS mit 0,5%BSA und 0,7 Millimole Calcium und Magnesium und divalente Kationen. BSA LPS frei wird bei einer Konzentration von 0,5% und Datum PBF verwendet. Die Platte wird dann über Nacht bei vier Grad Celsius übertragen.C1q dosisabhängige Wechselwirkungen mit immobilisierter Hyaluronsäure werden durch enzymgebundene Immun-SA bestimmt. Zellenbeschriftung mit schnellem DiI. Der lipophile Tracer schnell DiI wird verwendet, um die Zellen von Interesse zu kennzeichnen. Zellen, die in dPBS resuspendiert werden, werden in der Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter verwendet.Fast DiI wird einbis 100 direkt in die Zellsuspension verdünnt. Die Zellsuspension wird manuell gemischt und bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten übertragen. Nach fünf Minuten Inkubation die Zellsuspension mischen und diesen Vorgang noch zweimal wiederholen.Um den Überschuss an schnellem DiI zu entfernen, fügen Sie 10 Milliliter dPBS hinzu. Biegen Sie sieben Minuten lang sanft auf und ab und zentrieren Sie sich bei 250 g. Setzen Sie das Zellpellet in einem Milliliter des humanen endophilen Serum-freien Mediums in Gegenwart von 0,1%BSA aus.Zellen Haftung auf Hyaluronsäure C1q Matrizen. Vakuum-Aspirat der dPBS aus den beschichteten Brunnen. Verteilen Sie 100 Mikroliter beschrifteter Zellsuspension auf die beschichteten Brunnen.200 Mikroliter beschrifteter Zellen werden in einem Ependure-Rohr auseinandergenommen, um für die Standard-Kurvenerzeugung verwendet zu werden. Inkubieren Sie die Platte für 35 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator.Die unausgewogenen Zellen vorsichtig ansaugen. Einmal mit dPBS mit 0,5%BSA und 0,7 Millimolen Calcium und Magnesium waschen. Lys die anhaftenden Zellen durch Zugabe von 200 Mikroliter Lysepuffer.Gleichzeitig bereiten Sie die Standardkurve auf ein bis zwei serielle Verdünnung der beschrifteten Zellen im Lysepuffer vor. Führen Sie das Ablesen des Blütensignals bei unendlichen F 200 T-can-Instrumenten mit 544 Nanometern als Anregungswellenlänge und 590 Nanometern als Emissionswellenlänge durch. Repräsentative Ergebnisse.Wie die repräsentativen Ergebnisse zeigen, ist es offensichtlich, dass die Zelladhäsion auf Hyaluronsäure C1q als stark verbessert im Vergleich zu HA allein oder HA gebundenb BSA fand. Der Prozentsatz der anhaftenden Zellen in jeder Matrix wird auf der Grundlage der Standardkurve berechnet. Schlussfolgerungen. In unseren Experimenten haben wir zunächst die Fähigkeit der Komplementkomponente C12 bewertet, die extrazelluläre Matrix in diesem Fall Hyaluronsäure mit einem Arisalmetall zu binden.Zweitens analysierten wir die Fähigkeit menschlicher Primärzellen, die mit fluoreszierendem Farbstoff gefärbt sind, gebundene Hyaluronsäure zu verfolgen. Das Modell, das wir in dieser Studie vorgeschlagen haben, ist eine einfachere schnellere und billigere Methode als Alternative zum 3D-Modell von extrazellulären Matrixgerüsten für die Bewertung dieser zellulären Reaktion auf eine Kombination von Reizen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Depletion spezifischer Zellpopulationen durch Ergänzung Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum

Measuring the 50% Haemolytic Complement CH50 Activity of Serum

Die Messung der 50% Hämolytische Complement (CH 50) Aktivität von Serum

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Überwachung dendritische Zellen mit Migration<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

Sezieren Signalisierung Multi-Protein-komplexe durch eine Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

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Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

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Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

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The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...