Name: evaluation of the interplay between the complement protein c1q and hyaluronic acid in promoting cell adhesion
Uploaded: 2019-06-15T13:00:00
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Agradecemos a Ivan Donati pelo fornecimento de HA, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (departamento de Ginecologia da IRCCS "burlo Garofolo", Trieste, Itália) e Andrea Romano (unidade clínica operatória de anatomia e histologia patológica, hospital Cattinara, Trieste, Itália ) para a coleta de amostras de tecido. Agradecemos também Nicolò Morosini pela ajuda na preparação de vídeo e Alex Coppola, a voz. Este trabalho foi apoiado por subsídios do Instituto de saúde materna e infantil, IRCCS "burlo Garofolo", Trieste, Itália (RC20/16) e Fondazione Cassa di risparmio Trieste para R. Bulla.

Amostras de tecido de pacientes foram coletadas após consentimento informado após aprovação das considerações éticas pelo Conselho institucional do hospital universitário de Trieste, Itália.
1. isolamento e cultura de células tumorais (dia 1)
<ol><li>Isole pilhas humanas do mesotelioma dos espécimes contínuos do MPM. Picar finamente o tecido com um cortador para obter fragmentos de cerca de 2-3 mm2 em tamanho e incubar em 5 ml de solução de digestão composta de Hank...

<ol>
	<li>Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+hyaluronic+acid+in+immunoprotection+and+immunomodulation:+Chemistry,+processing+and+function.">The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function.</a> Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).</li><li>Lorusso, G., Ruegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis.">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li><li>Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+expression+and+function+of+the+macromolecular+c1+complex+on+the+surface+of+human+monocytes.">Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 38 (2012).</li><li>Laurent, T. C., Fraser, J. 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F., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+cell-matrix+interactions+in+hyaluronic+acid+hydrogel+scaffolds.">Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).</li></ol>

Nós descrevemos um método fácil para investigar como o componente do complemento, que interage com o ácido hialurônico, é capaz de modular o comportamento de células primárias isoladas de tecidos tumorais humanos. Tanto o HA quanto o n. º n estão presentes no microambiente tecidual em condições fisiológicas e patológicas, participando de diversos processos biológicos celulares. Por exemplo, foi demonstrado que o n. º-8 está presente no microambiente da placenta, onde favorece a invasão de trofoblastos t...

O microambiente do tumor (TME) influencia o desenvolvimento e a progressão do cancro desde que pode fornecer um Niche permissiva para a sobrevivência, o crescimento e a invasão da pilha. A identificação de novos atores-chave na TME pode ser útil para a descoberta de novas ferramentas moleculares para a terapia alvo. A TME inclui uma rede complexa e dinâmica de células não malignas, como células endoteliais, fibroblastos e células do sistema imunológico, encaixadas nos componentes da matriz extracelular circundante (ECM), incluindo colágenos, lamininas, fibronectinas, proteoglicanos e hyaluronans. Ambas as células tumorais e não-tumorais sintetizam e secretam componentes de ECM em conjunto com citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento e enzimas de remodelação inflamatória e matricial que alteram globalmente as propriedades físicas, químicas e de sinalização da TME. Entre esses constituintes, o ácido hialurônico (HA) surgiu para exercer um papel crucial na biologia tumoral. Apesar de sua simples composição química, a HA, juntamente com suas moléculas de ligação à HA (hialaderinas), pode modular a angiogênese, a responsividade do sistema imunológico e a remodelação do ECM de forma dependente de tamanho e concentração1.
O sistema complementar (C) também faz parte do TME local, que recentemente recebeu uma atenção crescente. O sistema C engloba um conjunto de proteínas solúveis e ligadas à membrana envolvidas na primeira linha de defesa contra não-células-auto, elementos hospedeiros indesejados e patógenos. Funcionalmente, o C vincula os braços de dois efetores de sistemas inatos e adaptativos para promover a matança direta de células ou a montagem de uma resposta inflamatória2. A ativação de C pode suprimir o crescimento do tumor, destruindo as células cancerosas ou inibindo seu crescimento, mas tornou-se cada vez mais claro que ele pode possuir uma atividade que promove o tumor, sustentando a inflamação crônica, promovendo o estabelecimento de um meio imunossupressor, induzindo a angiogênese e ativando as vias de sinalização relacionadas ao câncer3. Neste contexto, foi a primeira molécula de reconhecimento da via clássica do sistema C que tem emergido para exercer funções importantes no microambiente tumoral, independentemente da ativação do C4. Foi demonstrado que a r. 5 foi expressa localmente por uma série de tumores malignos humanos, onde pode favorecer a adesão, a migração e a proliferação de células cancerosas, além da angiogênese e metástasecinco. Curiosamente, a-n interage com um dos principais constituintes do ECM, como HA.
Nós desenvolvemos uma técnica para isolar as pilhas de cancro preliminares da massa de tumor. Além disso, nós criamos a matriz, que pode estimular o microambiente do tumor, particular a interação entre o de-o e o ácido hialurónico do peso molecular elevado. A capacidade para a HA foi capaz de induzir a adesão das células tumorais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1447px;" width="1445">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">100&#8201;&#181;m pore filter</td>
			<td style="width:311px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:131px;">352360</td>
			<td style="width:676px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Amphotericin B solution (fungizone)</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">basic FGF</td>
			<td style="width:311px;">Immunological Sciences</td>
			<td style="width:131px;">GRF-15595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">C-4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase type I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation, DBA</td>
			<td style="width:131px;">MX1D12644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Roche</td>
			<td style="width:131px;">10 104 159 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">EDTA</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:330px;">EGF</td>
			<td style="width:311px;">Immunological Sciences</td>
			<td style="width:131px;">GRF-10544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:330px;">FAST DiI</td>
			<td style="width:311px;">Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">D7756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:311px;">Gibco,&#160; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:311px;">Roche</td>
			<td style="width:131px;">11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Flask for cell culture</td>
			<td style="width:311px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">430639</td>
			<td>Sterile, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Gentamicin solution</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">G1397-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBBS)&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">H6648</td>
			<td>Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">High molecular weight hyaluronic acid</td>
			<td style="width:311px;">Kind gift by Prof. Ivan Donati</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Human endothelial serum free medium&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Gibco,&#160; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">11111-044</td>
			<td>Supplemented with EGF (5&#8201;ng/mL), basic FGF (10&#8201;ng/mL), and&#160; 1% penicillin&#8211;streptomycin (Sigma-Aldrich)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:311px;">Carlo Erba</td>
			<td style="width:131px;">13446-18-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medium 199 with Hank&#8217;s salt</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">M7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:330px;">Time-lapse microscopy&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Imaging System BioStation IM-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Titertek Multiskan ELISA Reader</td>
			<td>Flow Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">T4674</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the interplay between the complement protein c1q and hyaluronic acid in promoting cell adhesion

Tem sido demonstrado cada vez mais que o microambiente tumoral desempenha um papel ativo no crescimento e metástase da neoplasia. Através de diferentes vias, as células tumorais podem eficientemente recrutar células estromal, imunológicas e endoteliais secretando fatores estimulatórios, quimiocinas e citocinas. Por sua vez, essas células podem alterar as propriedades de sinalização do microambiente, liberando sinais de promoção de crescimento, metabólitos e componentes da matriz extracelular para sustentar alta proliferação e competência metastática. Neste contexto, identifica-se que o componente complementar-de-n, altamente expresso localmente por uma gama de tumores malignos humanos, ao interagir com o ácido hialurônico da matriz extracelular, afeta fortemente o comportamento das células primárias isoladas do tumor humano Espécimes. Aqui, nós descrevemos um método para testar como o-de-de-aço para o ácido hialurônico (HA) impacta a adesão de células tumorais, subjacente ao fato de que as propriedades biológicas dos principais componentes da matriz extracelular (neste caso HA) podem ser moldadas por sinais bioativos em direção ao tumor Progressão.

HA é um polissacárido de alto peso molecular carregado negativamente, que é composto de repetição (β,1-4)-D-glucurônico ácido-(β,1-3)-N-acetil-D-glucosamina dissacarínico unidades (Figura 1b)7. A ocorrência da ligação de HA na placa 96-well, bem como a eficiência de sua imobilização foram testadas aproveitando-se de HA biotinylated (bio-HA). Diferentes concentrações de bio-HA, variando de 10 μg/mL a 1 mg/mL, foram re...

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Evaluation of the Interplay Between the Complement Protein C1q and Hyaluronic Acid in Promoting Cell Adhesion

O componente complementar de-de-de-a é uma molécula pró-inflamatória altamente expressa no microambiente tecidual que pode interagir com a matriz extracelular. Aqui, nós descrevemos um método para testar como o-de-de-ácido hialurônico afeta a adesão celular.

Avaliação da interação entre o complemento protéico-de-n-n e ácido hialurônico na promoção da adesão celular

It has been increasingly demonstrated that the tumor microenvironment plays an active role in neoplasia growth and metastasis. Through different pathways, ...

Um procedimento abrangente para avaliar a interação entre a proteína complementar C1q e o ácido hialurônico na promoção da adesão celular. Recentemente definimos que o componente complementar C1q uma molécula do sistema imunológico inato é altamente expresso no microambiente tumor e placenta e é capaz de interagir com o componente da matriz extracelular. Neste caso, ácido hialurônico.Propomos um método para estudar as funções biológicas das proteínas em todo o ambiente ecronômico. A fim de investigar a capacidade dessas moléculas de moldar as propriedades de divisão celular de fatores de matriz extracelular. Para estudar como essa interação pode ser sentida pelas células presentes no tecido do ambiente, estabelecemos esse método fácil no qual células binárias derivadas de tecidos humanos foram autorizadas a aderir ao C1q ligado à matriz extracelular, neste caso o ácido hialurônico.Para o procedimento de revestimento, o primeiro passo é a ligação do ácido hialurônico de alto peso molecular a 96 microplacas revestidas de tecido. Para revestimento, o ácido hialurônico é diluído em 0,1 tampão de carbono mole PH 9.6 a uma concentração de 15 microgramas por mililitro. E a tubulação suave é correspondida para alcançar uma solução homogênea.100 microliters da solução são usados para revestir os poços. A placa é então transferida a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, aspirar os poços tratados.Lave uma vez com dPBS. Adicione C1q ou BSA nos poços correspondentes. C1q está hoje disponível comercialmente a uma concentração de um miligrama por mililitro e é diluído a uma concentração de 25 microgramas por mililitro.E dPBS contendo 0,5% BSA e 0,7 mililitros de cálcio e magnésio e cáções divalentas. BSA LPS livre é usado na concentração de 0,5% e data PBF. A placa é então transferida a quatro graus Celsius durante a noite.As interações dependentes da dose C1q com ácido hialurônico imobilizado são determinadas pela enzima ligada ao imuno SA. Rotulagem de células com DII rápido. O rastreador lipofílico rápido DiI é usado para rotular as células de interesse. As células resuspendadas em dPBS são usadas na concentração de um milhão de células por mililitro.DiI rápido é diluído de 1 a 100 diretamente na suspensão da célula. A suspensão da célula é misturada manualmente e transferida a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após cinco minutos de incubação, misture a suspensão da célula e repita esta operação mais duas vezes.Para remover o excesso de DII rápido, adicione 10 mililitros de dPBS. Gire suavemente para cima e para baixo e centrífuga a 250 g por sete minutos. Resuspend a pelota celular em um mililitro de soro endofilical humano sem meio na presença de 0,1%BSA.Células adesão em matrizes de ácido hialurônico C1q. Aspirar a vácuo o dPBS dos poços revestidos. Distribua 100 microliters de suspensão celular rotulada aos poços revestidos.200 microliters de células rotuladas são desmontados em um tubo de ependure para ser usado para a geração de curvas padrão. Incubar a placa por 35 minutos a 37 graus Celsius. Tire a placa da incubadora.Aspire suavemente as células desequilibrada. Lave uma vez com dPBS contendo 0,5% BSA e 0,7 mililitros de cálcio e magnésio. Lys as células aderentes adicionando 200 microliters de tampão de lise.Ao mesmo tempo, prepare a curva padrão sobre uma a duas diluições seriais das células rotuladas no tampão de lise. Realize a leitura do sinal de floresnce no instrumento F 200 T-can infinito usando 544 nanômetros como comprimento de onda de excitação e 590 nanômetros como comprimento de onda de emissão. Resultados representativos.Como mostrado pelos resultados representativos, é evidente que a adesão celular ao ácido hialurônico encontrou C1q como fortemente aprimorada em comparação com HA sozinho ou HA ligado BSA. A porcentagem de células aderentes em cada matriz é calculada com base na curva padrão. Conclusões. Em nossos experimentos, em primeiro lugar, avaliamos a capacidade do componente complementar C12 de ligar a matriz extracelular neste caso ácido hialurônico usando um metal arisal.Em segundo lugar, analisamos a capacidade das células primárias humanas manchadas com corante fluorescente para perseguir ácido hialurônico ligado. O modelo que propusemos neste estudo é um método mais fácil e mais rápido e barato em alternativa ao modelo 3D de andaimes de matriz extracelular para avaliação nesta resposta celular a uma combinação de estímulos.

Research

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Monitoramento da Migração de Células dendríticas usando<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Ressonância Magnética

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