Name: evaluation of the interplay between the complement protein c1q and hyaluronic acid in promoting cell adhesion
Uploaded: 2019-06-15T13:00:00
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Agradecemos a Ivan Donati por proporcionar ha, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (Departamento de Ginecología de IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italia) y Andrea Romano (Unidad Clínica Operativa de Anatomía e Histología Patológica, Hospital Cattinara, Trieste, Italia ) para la recogida de muestras de tejido. Agradecemos también a Nicolá Morosini por la ayuda en la preparación del video y a Alex Coppola, la voz. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto de Salud Maternoinfantil, IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italia (RC20/16) y Fondazione Cassa di Risparmio Trieste a R.Bulla.

Las muestras de tejido de los pacientes fueron recogidas después del consentimiento informado tras la aprobación de las consideraciones éticas por el Consejo Institucional del Hospital Universitario de Trieste, Italia.
1. Aislamiento y cultivo de células tumorales (Día 1)
<ol><li>Aísle las células del mesotelioma humano de las muestras sólidas de MPM. Picar finamente el tejido con un cortador para obtener fragmentos de aproximadamente 2-3 mm2 de tamaño e incubar en 5 ml d...

<ol>
	<li>Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+hyaluronic+acid+in+immunoprotection+and+immunomodulation:+Chemistry,+processing+and+function.">The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function.</a> Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).</li><li>Lorusso, G., Ruegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis.">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li><li>Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. 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N., Birkinshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+solutions:+A+processing+method+for+efficient+chemical+modification.">Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification.</a> Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).</li><li>Itano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+primary+structure,+complex+turnover+regulation+and+multiple+roles+of+hyaluronan.">Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan.</a> Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).</li><li>Agostinis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+role+of+C1q+in+cell+migration+and+tissue+remodeling:+contribution+to+trophoblast+invasion+and+placental+development.">An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development.</a> Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).</li><li>Agostinis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+Protein+C1q+Binds+to+Hyaluronic+Acid+in+the+Malignant+Pleural+Mesothelioma+Microenvironment+and+Promotes+Tumor+Growth.">Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1559 (2017).</li><li>Bossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1q+as+a+unique+player+in+angiogenesis+with+therapeutic+implication+in+wound+healing.">C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).</li><li>Hosszu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+expression+and+function+of+the+macromolecular+c1+complex+on+the+surface+of+human+monocytes.">Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 38 (2012).</li><li>Laurent, T. C., Fraser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan.">Hyaluronan.</a> Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).</li><li>Gaboriaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+globular+head+of+complement+protein+C1q+provides+a+basis+for+its+versatile+recognition+properties.">The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).</li><li>Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+cell-matrix+interactions+in+hyaluronic+acid+hydrogel+scaffolds.">Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).</li></ol>

Describimos un método fácil para investigar cómo el componente de complemento C1q, interactuando con el ácido hialurónico, es capaz de modular el comportamiento de las células primarias aisladas de los tejidos tumorales humanos. Tanto HA como C1q están abundantemente presentes en el microambiente tisular tanto en condiciones fisiológicas como patológicas, participando en varios procesos biológicos celulares. Por ejemplo, se ha demostrado que C1q está presente en el microambiente de la placenta, donde favorece ...

El microambiente tumoral (TME) influye en el desarrollo y la progresión del cáncer, ya que puede proporcionar un nicho permisivo para la supervivencia celular, el crecimiento y la invasión. La identificación de nuevos actores clave en TME puede ser útil para el descubrimiento de nuevas herramientas moleculares para la terapia diana. TME incluye una red compleja y dinámica de células no malignas, como células endoteliales, fibroblastos y células del sistema inmunitario, incrustadas en los componentes de la matriz extracelular (ECM) circundantes, incluyendo colágenos, laminines, fibronectinas, proteoglicanos e hialuronanos. Tanto las células tumorales como las no tumorales sintetizan y secretan componentes de ECM junto con citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y enzimas de remodelación inflamatorias y matriciales que alteran en general las propiedades físicas, químicas y de señalización de TME. Entre estos componentes, el ácido hialurónico (HA) ha surgido para ejercer un papel crucial en la biología tumoral. A pesar de su simple composición química, HA, junto con sus moléculas de unión HA (hialadherinas), puede modular la angiogénesis, la capacidad de respuesta del sistema inmune y la remodelación de ECM de una manera dependiente del tamaño y la concentración1.
El sistema de complemento (C) también forma parte del TME local, que recientemente ha recibido una atención cada vez mayor. El sistema C abarca un conjunto de proteínas solubles y unidas a membranaimplicadas en la primera línea de defensa contra las no autocélulas, los elementos huésped no deseados y los patógenos. Funcionalmente, la C une los brazos de dos efectos de los sistemas innatos y adaptativos para promover la matanza directa de células o el montaje de una respuesta inflamatoria2. La activación c puede suprimir el crecimiento tumoral, destruyendo las células cancerosas o inhibiendo su crecimiento, pero se ha vuelto cada vez más claro que puede poseer una actividad que promueve el tumor al sostener la inflamación crónica, promoviendo el establecimiento de un ambiente inmunosupresor, induciendo angiogénesis y activando vías de señalización relacionadas con el cáncer3. En este contexto, C1q, la primera molécula de reconocimiento de la vía clásica del sistema C ha surgido para ejercer importantes funciones en el microambiente tumoral independientemente de la activación C4. C1q ha demostrado ser expresado localmente por una gama de tumores malignos humanos, donde puede favorecer laadhesión de las células cancerosas, la migración y la proliferación, además de la angiogénesis y la metástasis 5. Curiosamente C1q interactúa con un componente importante del ECM como HA.
Desarrollamos una técnica para aislar las células cancerosas primarias de la masa tumoral. Además, creamos la matriz, que puede estimular el microambiente tumoral, particularmente la interacción entre C1q y el ácido hialurónico de alto peso molecular. C1q unido a HA fue capaz de inducir la adhesión de las células tumorales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1447px;" width="1445">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">100&#8201;&#181;m pore filter</td>
			<td style="width:311px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:131px;">352360</td>
			<td style="width:676px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Amphotericin B solution (fungizone)</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">basic FGF</td>
			<td style="width:311px;">Immunological Sciences</td>
			<td style="width:131px;">GRF-15595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">C-4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase type I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation, DBA</td>
			<td style="width:131px;">MX1D12644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Roche</td>
			<td style="width:131px;">10 104 159 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">EDTA</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:330px;">EGF</td>
			<td style="width:311px;">Immunological Sciences</td>
			<td style="width:131px;">GRF-10544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:330px;">FAST DiI</td>
			<td style="width:311px;">Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">D7756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:311px;">Gibco,&#160; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:311px;">Roche</td>
			<td style="width:131px;">11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Flask for cell culture</td>
			<td style="width:311px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">430639</td>
			<td>Sterile, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Gentamicin solution</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">G1397-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBBS)&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">H6648</td>
			<td>Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">High molecular weight hyaluronic acid</td>
			<td style="width:311px;">Kind gift by Prof. Ivan Donati</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Human endothelial serum free medium&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Gibco,&#160; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">11111-044</td>
			<td>Supplemented with EGF (5&#8201;ng/mL), basic FGF (10&#8201;ng/mL), and&#160; 1% penicillin&#8211;streptomycin (Sigma-Aldrich)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:311px;">Carlo Erba</td>
			<td style="width:131px;">13446-18-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medium 199 with Hank&#8217;s salt</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">M7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:330px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:330px;">Time-lapse microscopy&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Imaging System BioStation IM-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Titertek Multiskan ELISA Reader</td>
			<td>Flow Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">T4674</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the interplay between the complement protein c1q and hyaluronic acid in promoting cell adhesion

Se ha demostrado cada vez más que el microambiente tumoral desempeña un papel activo en el crecimiento de la neoplasia y la metástasis. A través de diferentes vías, las células tumorales pueden reclutar eficientemente células estromales, inmunes y endoteliales mediante el secreto de factores estimulantes, quimioquinas y citoquinas. A su vez, estas células pueden alterar las propiedades de señalización del microambiente mediante la liberación de señales, metabolitos y componentes de matriz extracelular que promueven el crecimiento para mantener una alta proliferación y competencia metastásica. En este contexto, identificamos que el componente de complemento C1q, altamente expresado localmente por una serie de tumores malignos humanos, al interactuar con la matriz extracelular de ácido hialurónico, afecta fuertemente el comportamiento de las células primarias aisladas del tumor humano Especímenes. Aquí, describimos un método para probar cómo C1q unido al ácido hialurónico (HA) afecta la adhesión de las células tumorales, subyacente al hecho de que las propiedades biológicas de los componentes clave de la matriz extracelular (en este caso HA) pueden ser moldeadas por señales bioactivas hacia el tumor Progresión.

La HA es un polisacárido de alto peso molecular cargado negativamente, que se compone de unidades de disacárido de repetición (1-4)-D-glucurónico-(-,1-3)-N-acetil-D-glucosamina disacárido (Figura1B)7. La aparición de la unión de HA en la placa de 96 pocillos, así como la eficiencia de su inmovilización se probaron aprovechando el HA biotinilado (bio-HA). Las diferentes concentraciones de Bio-HA, que van desde 10 g/ml a 1 mg/ml...

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Evaluation of the Interplay Between the Complement Protein C1q and Hyaluronic Acid in Promoting Cell Adhesion

El componente de complemento C1q es una molécula proinflamatoria altamente expresada en el microambiente tisular que puede interactuar con la matriz extracelular. Aquí, describimos un método para probar cómo C1q unido al ácido hialurónico afecta la adhesión celular.

Evaluación de la interacción entre el complemento proteína C1q y el ácido hialurónico en la promoción de la adhesión celular

It has been increasingly demonstrated that the tumor microenvironment plays an active role in neoplasia growth and metastasis. Through different pathways, ...

Un procedimiento integral para evaluar la interacción entre la proteína de complemento C1q y el ácido hialurónico en la promoción de la adhesión celular. Recientemente hemos definido que el componente de complemento C1q una molécula del sistema inmunitario innato está muy expresada en el microambiente tumoral y placenta y es capaz de interactuar con el componente de la matriz extracelular. En este caso, ácido hialurónico.Proponemos un método para estudiar las funciones biológicas de las proteínas en todo el entorno ecronómico. Con el fin de investigar la capacidad de estas moléculas para dar forma a las propiedades de división celular de los factores de matriz extracelular. Con el fin de estudiar cómo esta interacción puede ser detectada por las células presentes en el tejido del medio ambiente, configuramos este método fácil en el que las células binarias derivadas de los tejidos humanos se les permitió adherirse a C1q unido a la matriz extracelular, en este caso ácido hialurónico.Para el procedimiento de recubrimiento el primer paso es la unión de ácido hialurónico de alto peso molecular a 96 microplacas bien recubiertas de tejido. Para el recubrimiento, el ácido hialurónico se diluye en 0,1 mole buffer de carbono PH 9.6 a una concentración de 15 microgramos por mililitro. Y la tubería suave es requited para lograr una solución homogénea.Se utilizan 100 microlitros de la solución para recubrir los pozos. La placa se transfiere a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente aspira el vacío de los pozos tratados.Lavar una vez con dPBS. Agregue C1q o BSA en los pozos correspondientes. C1q está actualmente disponible comercialmente a una concentración de un miligramo por mililitro y se diluye a una concentración de 25 microgramos por mililitro.Y dPBS que contiene 0.5%BSA y 0.7 milimolemoles calcio y magnesio y cationes divalentes. BSA LPS free se utiliza a la concentración de 0.5% y fecha PBF. La placa se transfiere a cuatro grados centígrados durante la noche.Las interacciones dependientes de la dosis C1q con ácido hialurónico inmovilizado se determinan mediante inmuno SA vinculado a enzimas. Etiquetado de células con DiI rápido. El trazador lipofílico diI rápido se utiliza para etiquetar las células de interés. Las células resuspendidas en dPBS se utilizan a la concentración de un millón de células por mililitro.DiI rápido se diluye de uno a 100 directamente en la suspensión celular. La suspensión celular se mezcla manualmente y se transfiere a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Después de cinco minutos de incubación, mezcle la suspensión celular y repita esta operación dos veces más.Para eliminar el exceso de DiI rápido, agregue 10 mililitros de dPBS. Gire suavemente hacia arriba y hacia abajo y centrifugar a 250 g durante siete minutos. Resuspender el gránulo celular en un mililitro de medio libre de suero endofilo humano en presencia de 0.1%BSA.Adhesión de células en matrices C1q de ácido hialurónico. Aspirar al vacío el dPBS de los pozos recubiertos. Distribuya 100 microlitros de suspensión celular etiquetada a los pozos recubiertos.200 microlitros de células etiquetadas se desmontan en un tubo de ependure que se utilizará para la generación de curvas estándar. Incubar la placa durante 35 minutos a 37 grados centígrados. Saque el plato de la incubadora.Aspirar suavemente las células desequilibradas. Lavar una vez con dPBS que contiene 0.5%BSA y 0.7 milimolemoles de calcio y magnesio. Lys las células adherentes mediante la adición de 200 microlitros de tampón de lelisis.Al mismo tiempo, prepare la curva estándar sobre una o dos diluciones en serie de las células etiquetadas en el búfer de lelisis. Realice la lectura de la señal de florescencia en el infinito instrumento F 200 T-can utilizando 544 nanómetros como longitud de onda de excitación y 590 nanómetros como longitud de onda de emisión. Resultados representativos.Como muestran los resultados representativos, es evidente que la adhesión celular en el ácido hialurónico encontró C1q como fuertemente mejorado en comparación con HA solo o HA unido BSA. El porcentaje de celdas adherentes en cada matriz se calcula sobre la base de la curva estándar. Conclusiones. En nuestros experimentos primero evaluamos la capacidad del componente de complemento C12 para unir la matriz extracelular en este caso el ácido hialurónico utilizando un metal arisal.En segundo lugar analizamos la capacidad de las células primarias humanas manchadas con tinte fluorescente para perseguir el ácido hialurónico unido. El modelo que propusimos en este estudio es un método más fácil y barato en alternativa al modelo 3D de andamios de matriz extracelular para la evaluación de esta respuesta celular a una combinación de estímulos.

Research

JoVE Journal

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