Name: identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Detta arbete stöddes främst av de av USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236, och delvis av USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Denna studie stöddes delvis av en utnämning till jordbruks Service forskning deltagande forskningsprogrammet administreras av Oak Ridge Institutet för vetenskap och utbildning (ORISE) via en institutionsöverskridande avtal mellan oss Department of Energy ( DOE) och US Department of Agriculture. ORISE sköts av Oak Ridge associerade universiteten under DOE kontrakt inte. DE-AC05-06OR2310.
Vi vill tacka Dr Kay Faaberg för HP-PRRSV smittsamma klonerna, Dr Susan Brockmeier för hennes hjälp med djur involverad i experimentet, och Sue Ohlendorf för kontorstjänster i beredning av manuskriptet.

Djur protokoll godkändes av National Animal Disease Center (USDA-ARS-NADC) djur vård och användning kommittén.
1. insamling av svin blod prover
<ol><li>Samla in blodprover i RNA-rör. Samla in ~2.5 mL eller mer om större samling rör finns tillgängliga.</li>
</ol>2. behandling av svin blod prover
<ol><li>Centrifugera blodet rören vid 5 020 x g under 10 minuter vid rumstemperatur (15-25 ° C). Om bearbetning frysta prover Inkubera röret i rumstempera...

<ol>
	<li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq:+challenges+and+strategies+for+data+analysis.">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li><li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature.">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084 (2014).</li><li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection.">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412 (2015).</li><li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli.">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).</li><li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+construction+for+next-generation+sequencing:+overviews+and+challenges.">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity.">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection.">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+(HP-PRRSV).">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).</li><li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis.">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing.">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly(A)+RNA+Library.">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9 (2015).</li><li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples.">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TruSeq&#174;+Stranded+Total+RNA+Sample+Preparation+Guide.">TruSeq&#174; Stranded Total RNA Sample Preparation Guide.</a> Illumina. , (2018).</li><li>. New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018)</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion.">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).</li><li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq.">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer.">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li></ol>

Ett första viktigt steg i det protokoll som gjorde det optimerade ingår extra globinzinkinsulin utarmning stegen, vilket gjorde det möjligt att få kvalitet läsningar från helblod prover. En av de största begränsningarna på använder helblod i sekvensering studier är det stora antalet läsningar i provet som kommer att mappa till globin molekyler och minska den läser som kan mappas till andra molekyler intresse18. Optimera i protokollet för våra provtyp, behövde vi, införliva en glob...

Nästa generations sekvensering (NGS) har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för undersökningen av de förändringar som sker på genomisk nivå av biologiska organismer. Provberedning för NGS metoder kan varieras beroende på organismen, vävnadstyp, och viktigare frågorna forskarna är angelägen om att adressen. Många studier har vänt sig till NGS som ett sätt att studera skillnader i genuttryck mellan stater som friska och sjuka individer1,2,3,4. Den sekvensering ta plats på basis av hela genomet och tillåter forskare att fånga mest, om inte alla, genomisk information för en viss genetisk markör i taget pekar.
De vanligaste markörerna för uttryck som observerats är de messenger RNA (mRNA). De mest använda förfarandena för prepping bibliotek för RNA-seq är optimerade för återvinning av mRNA-molekyler med hjälp av en serie av reningar, splittringarna och nering5,6. Men är beslutet om hur ett protokoll ska utföras starkt beroende provtypen och frågor som om nämnda exempel. I de flesta fall är total-RNA extraherade; ännu, inte alla RNA-molekyler är av intresse och i sådana fall som mRNA uttryck studier alltför riklig RNA arter, som ribosomalt RNA (rRNA) måste tas bort för att öka antalet detekterbara avskrifter är associerad med mRNA. Den mest populära och mest använda metoden för att ta bort de rikliga rRNA-molekylerna är minskningen av polyadenylated RNA avskrifter som polyA utarmning7. Denna metod fungerar bra för analys av mRNA uttryck eftersom det inte påverkar mRNA avskrifter. Dock i studier som är intresserad av icke-kodande eller viral RNAs, polyA utarmning tar också bort dessa molekyler.
Många studier väljer att fokusera på RNA-sekvens bibliotek beredning att undersöka antingen mRNA uttryck (kodning) eller en särskild klass av små eller stora icke-kodande RNA. Det finns andra förfaranden8 som vår som tillåter dubbla provpreparering, förbereda många studier bibliotek från separata prover för separata studier när det är tillgängligt. För en studie som vår kräver detta normalt flera blodprov öka tid, förbrukningsvaror och djurens stress. Syftet med vår studie var att kunna använda helblod från djur att identifiera och kvantifiera de olika klasserna av både mRNA och icke-kodande RNA uttryckt mellan friska och högpatogen porcin reproduktions- och respiratorisk virus (HP-PRRSV) utmanade svin9,10 trots att endast ett enda helblod prov (2,5 mL) från varje gris. För att göra detta, behövs vi för att optimera de typiska utvinning och bibliotek skapande protokoll att generera korrekt data för analys av både mRNA och icke-kodande RNA (ncRNA) uttryck11 från ett enda prov.
Detta föranledde ett behov av ett protokoll som möjliggjorde mRNA och icke-kodande RNA analys eftersom tillgängliga standard kit och metoder för RNA-extraktion och bibliotek skapande var huvudsakligen avsedda för mRNA och använda en poly-A utarmning steg12. Detta steg skulle ha gjort det omöjligt att återställa icke-kodande RNA eller viral avskrifter från provet. Därför behövdes en optimerad metod som tillåts för total RNA-extraktion utan provet polyA utarmning. Metoden presenteras i detta manuskript har optimerats för användning av helblod som en Provtyp och bygga sekvensering bibliotek för både mRNA och ncRNAs av små och stora storlekar. Metoden har optimerats för att möjliggöra analys av alla detekterbara icke-kodande RNAs samt behålla viral RNAs för senare undersökning13. I alla tillåter vår optimerade bibliotek förberedelse protokoll för utredning av flera RNA-molekyler från ett enda hela blodprov.
Det övergripande målet bakom användningen av denna metod var att utveckla en process som tillåts för insamling av både icke-kodande RNA och mRNA från ett prov av helblod. Detta tillåter oss att ha mRNA, ncRNA och viral RNA för varje djur i vår studie som anskaffas från en enda prov9. Detta, i slutändan, möjliggör mer vetenskapliga upptäckter utan animaliska merkostnader och ger en mer komplett bild av uttrycket av varje enskilt prov. Den beskrivna metoden tillåter för undersökning av regulatorerna av genuttryck samt möjliggör komplettering av korrelat studier jämför både mRNA och icke-kodande RNA uttryck helblod prov. Vår studie använde detta protokoll för att undersöka förändringar i genuttryck och möjliga epigenetiska tillsynsmyndigheter i viralt infekterade 9 - veckor gammal kommersiella galtar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">PAXgene Tubes</td>
			<td style="width:159px;">PreAnalytix</td>
			<td style="width:131px;">762165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Rneasy MinElute Clean Up Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:159px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">0.2 mL thin-walled tubes</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">98010540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">1.5 mL RNase/DNase - free tubes</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Veriti 96-well Thermocycler</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4375786R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X Oligo Hybridization Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-KCl</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">60142-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X RNase H Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-DTT</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">Y00147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">&#160;-MgCl2</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">A351B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase H</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SUPERase-IN</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2694</td>
			<td>Rnase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EDTA</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">G2938C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent High Sensitivity DNA&#160; Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;">RS-122-2201</td>
			<td>mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A&#160; (48 samples, 12 indexes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Available on-line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNAClean XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010580</td>
			<td>0.2 ml thin-walled tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N801-0535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase/DNase - free reagent reservoirs</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 96 well plates</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010560</td>
			<td>These were used in place of .3mL plates as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 1)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E73005</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 2)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E75805</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">QIAQuick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">96S Super Magnet Plate</td>
			<td style="width:159px;">ALPAQUA</td>
			<td style="width:131px;">A001322</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood

Tillkomsten av innovativ och allt mer kraftfulla nästa generations sekvensering teknik har öppnat nya vägar till möjlighet att undersöka de underliggande genuttryck relaterade till biologiska processer av intresse. Dessa innovationer inte bara tillåter forskare att iaktta uttryck från de mRNA-sekvenser som kodar för gener att effekt cellulär funktion, men också de icke-kodande RNA (ncRNA)-molekyler som förblir oöversatta, men ändå har tillsynsuppgifter. Även om forskare har möjlighet att iaktta både mRNA och ncRNA uttryck, har det varit brukligt för en studie för att fokusera på ena eller andra. Men när studierna är intresserad av både mRNA och ncRNA uttryck, använda många gånger de separata prover för att undersöka antingen kodning eller icke-kodande RNAs på grund av skillnaden i biblioteket preparat. Detta kan leda till behov av fler prover som kan öka tid, förbrukningsvaror och djurens stress. Det kan dessutom orsaka forskare att välja att förbereda prover för endast en analys, vanligtvis mRNA, begränsa antalet biologiska frågor som kan undersökas. Dock ncRNAs spänner över flera klasser med föreskrivande roller att effekt mRNA uttryck. Eftersom ncRNA är viktiga grundläggande biologiska processer och störning i dessa processer i under infektion, kan de alltså göra attraktiva mål för therapeutics. Detta manuskript visar ett modifierat protokoll för generation mRNA och icke-kodande RNA uttryck bibliotek, inklusive viral RNA, från ett enda prov av helblod. Optimering av detta protokoll, förbättrad RNA renhet, ökade ligering för återvinning av metylerade RNAs och utelämnas storlek urval, för att tillåta fångst av fler RNA arter.

De representativa proverna i vår studie är globin och ribo-utarmat helblod prover. Representativa resultatet i protokollet består av ett globinzinkinsulin utarmat bibliotek prov med ett RNA integritet nummer (RIN) ovan 7 (figur 1en) och 260/280 nm koncentration nyckeltal vid eller över 2 (figur 1b och 1 c). Validering av provet resultatet utfördes med spektrofotometer för att ge varje bibli...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Här presenterar vi ett protokoll optimerad för bearbetning av kodning (mRNA) och icke-kodande (ncRNA) globinzinkinsulin minskat RNA-seq bibliotek från ett enda hela blodprov.

Identifiering av kodning och icke-kodande RNA klasser uttryckta i svin helblod

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i studien av värd-patogen interaktioner genom att tillåta undersökning av kodning, icke-kodning, och viral RNA uttryck som deltar i värd aminosvaret samt hur en patogen kan påverka värdens biologiska funktioner. Den största fördelen med denna teknik är det presenterar ett protokoll optimerat för bearbetning av mRNA och icke-kodande RNA från globin-reducerade RNAseq bibliotek från ett enda helt blodprov. Demonstrerar tekniken blir Sarah Anderson, en tekniker från mitt laboratorium.Börja med att centrifugera blodrören vid 50 20 gånger G i 10 minuter vid rumstemperatur. Arbeta i ett biologiskt säkerhetsskåp, efter att ha tagit bort supernatanten, tillsätt åtta milliliter RNase-fritt vatten till pelleten. Stäng rören och vortexa pelleten tills den är synligt upplöst, sedan centrifugera rören vid 50 20 gånger G i 10 minuter vid rumstemperatur för att återvinna pelleten.Arbeta i ett biologiskt säkerhetsskåp, kassera supernatanten och spara pelleten. För att isolera totalt RNA, börja med pipettering 300 mikroliter av lysbindande buffert till pelleten. Efter vortexing, överför blandningen från varje rör till en ny märkt 1,5 milliliter centrifugerör.Tillsätt 30 mikroliter av homogenitiv från miRNA-isoleringssatsen. Vortexa rören och placera på isen i 10 minuter. Arbeta i en rökhuva, ta bort rören från is och tillsätt 300 mikroliter av syra fenol kloroform reagens från satsen och virvel igen för att blanda.Efter centrifugering vid 10, 000 gånger G i fem minuter vid rumstemperatur, ta försiktigt bort vattenfas till ett nytt rör. Baserat på mängden vattenhaltig återhämtning från föregående steg, tillsätt 1,25 gånger volymen av 100%etanol till vattenhaltiga i varje rör och pipett att blanda. Preparera färska uppsamlingsrör som innehåller en filterpatron för varje prov.Pipett cirka 675 mikroliter av lysate-etanolblandningen på filterpatronen. Centrifugera kort vid 10, 000 gånger G för att passera vätska genom filtret. Kassera genomflödet.Upprepa lysate-etanolblandningen som tillsätts i filtret och centrifugeringen tills den har använts helt. Lägg till 700 mikroliter av tvättlösning en från satsen till filterpatronen. Centrifugera kort för att dra lösningen genom filtren.Kassera genomflödet och behåll samma filterpatroner och uppsamlingsrör. Lägg till 500 mikroliter av tvättlösning två-tre till varje filterpatron. Efter centrifugering igen, kassera genomströmningen och upprepa tvättsteget.För att ta bort eventuell kvarvarande vätska från filterpatronerna, snurra dem ytterligare 60 sekunder. Överför patronerna till färska uppsamlingsrör. Tillsätt 100 mikroliter med 95 grader Celsius förvärmt nukleasfritt vatten till mitten av varje filterpatron.Centrifugera patronerna i ungefär 20 till 30 sekunder vid bordsskivan centrifug med maximal hastighet. För att preforma hybridisering med globin reduktion oligos, först denaturera RNA genom att lägga till varje extraherade prov i en 0,2 milliliter tunnväggiga nukleas-fri reaktionsrör. Placera rören i en termisk cycler på 70 grader Celsius i två minuter.Därefter placerar du omedelbart rören på is för att få optimal RNA-kvalitet. Medan rören är kylning, förbereda 400 mikroliter av 10X globin minskning oligo mix och 10X oligo hybridisering buffert i en två milliliter rör. För att göra hybridisering mix, tillsätt sex mikrogram RNA prov, två mikroliter av 10X globin minskning oligo mix, en mikroliter av 10X oligo hybridisering buffert, och nukleas fritt vatten till en slutlig volym av 10 mikroliter till varje 0,2 milliliter tunnväggiga, nuklea-fri reaktionsrör.Placera rören i termiska cycler på 70 grader Celsius i två minuter. Därefter placerar du omedelbart rören på is. För att utföra RNase H-matsmältning, späd först ut 10X RNase H till en X RNase H med en X RNase H-buffert.Förbered RNase H reaktionsmix genom att kombinera två mikroliter av 10X RNase buffert, en mikroliter av RNase-hämmare, och två mikroliter av en X RNase H, och fem mikroliter kärnfri vatten till en total volym av 10 mikroliter. Tillsätt 10 mikroliter av RNase H reaktionsmixen till globinreduktionshybridiseringsproverna och blanda noggrant. Digest denna reaktion vid 37 grader Celsius i 10 minuter och sedan svalna till fyra grader Celsius.Stoppa matsmältningen genom att lägga till en mikroliter av 0,5 molar EDTA till röret, och överföra hela halten av röret till en färsk 1,5 milliliter rör. Omedelbart efter det, tillsätt 80 mikroliter av RNase-fritt vatten, 350 mikroliter av lysbuffert, sedan 250 mikroliter av 100%etanol till varje rör och blanda väl genom pipettering. Överför varje 700 mikroliterprov till en separat elueringsfilterpatron som placeras i två milliliter uppsamlingsrör för att samla in genomströmningen.Centrifugera i 15 sekunder vid 8, 000 gånger G eller större och sedan kassera genomflödet. Placera samma elueringsfilterpatroner i nya två milliliter uppsamlingsrör. För att tvätta filterpatronmembranen, tillsätt 500 mikroliter av den milda tvättbufferten till filterpatronerna och centrifugen i 15 sekunder vid 8, 000 gånger G eller större.Kassera genomflödet. Sedan, med hjälp av samma samlingsrör, tillsätt 500 mikroliter av 80%etanol till filterpatronerna. Centrifugera i två minuter vid 8, 000 gånger G och större.Kassera både genomströmnings- och uppsamlingsrören, och spara spinnkolumnerna för eluering. Placera varje elueringspinnkolonn i ett nytt två milliliter uppsamlingsrör. Centrifugera i full fart i fem minuter med det öppna locket på filterpatroner för att torka spinnpelarmembranen och förhindra etanol carryover.Placera varje torkad filterpatron i ett färskt 1,5 milliliter uppsamlingsrör efter att de kasserats av uppsamlingsrören. Tillsätt 14 mikroliter RNase-fritt vatten direkt till mitten av filterpatronmembranet. För att elera RNA, centrifugera rören i 60 sekunder med full fart och fortsätt sedan med ytterligare RNA-bedömning och beredning.Det globinuttade provet kan nu delas upp och användas för att förbereda de små, icke-kodande RNA-biblioteken samt de riboutarmade mRNA och långa, icke-kodande RNA-biblioteken. Efter att ha förberett uttryck bibliotek av globin-utarmat och ribo-utarmat helblod prover med hjälp av detta protokoll, visade electrophoresis fil köra sammanfattning en globin-utarmat bibliotek prov med RNA integritet nummer som varierade från 6,3 till 9,2. Detta visade sig vara en förbättring jämfört med andra studier som använde globin utarmning metoder och kunde bara uppnå RIN nummer vid eller nära sex.Pre-globin-reduktion och post-globin-minskning av en enda porcine helblod prov visade att 260 till 280 nanometer koncentrationsförhållanden är på eller över två. Med hjälp av detta protokoll erhölls chip-baserade elektroferogram av globin- och ribo-utarmat helblod mRNA bibliotek prover före poolning och sekvensering. För mRNA-biblioteken har det representativa elektroferogrammet en topp på ungefär 280 baspar.För de små ncRNAs representativa chip-baserade elektroferogram innehåller en rad toppar från cirka 100 till 400 baspar. Toppar vid ungefär 143 baspar motsvarar miRNAs, och toppar vid cirka 153 baspar motsvarar piRNAs. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att isrör omedelbart där det noteras.Efter denna procedur bör andra metoder såsom nästa generations sekvensering utföras för att kunna besvara ytterligare frågor som differentiellt uttryck, epigenetiska förändringar och deras effekt på biologiska vägar och processer. Glöm inte att arbeta med fenol-kloroform reagens är extremt farligt och försiktighetsåtgärder som att arbeta i en rök huva bör vidtas. Vid hantering av helblod eller infektiösa organismer bör också arbete utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp före en aktivering av den smittsamma organismen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Ett 1,5 timme Förfarande för identifikation av Enterococcus Arter Direkt från blododlingar

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Räkning av Stora perifera populationer blodleukocyt för kliniska multicenterstudier Använda en hel analys Blood Fenotypning

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snabb identifiering av gramnegativa bakterier från Blood Culture Broth Använda MALDI-TOF masspektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Framställning av en Blood Culture Pellet för Rapid Bacterial Identifiering och Antibiotikum resistensbestämning

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell för att studera interaktioner mellan humant helblod och endotelet

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nukleokapsid Annealing-medierad elektrofores (NAME) Analys Tillåter snabb identifiering av HIV-1 nukleokapsiden Hämmare

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flödescytometrisk analys av Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant helblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från helblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran effektiviserar Lentiviral transduktion murina och mänskliga primära NK-celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Single-cell analys av Immunophenotype och cytokin produktion i perifera helblod via massa flödescytometri

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...