Name: quantifying leukocyte egress via lymphatic vessels from murine skin and tumors
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Die Autoren möchten Dr. Marcus Bosenberg danken für die Bereitstellung YUMM 1.1 und 1.7 YUMM murinen Melanom Linien und Dr. Deborah J. Fowell für die Bereitstellung von B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr Mäuse im Einvernehmen mit RIKEN BRC durch nationale Bio-Ressource des MEXT, Japan.

Alle tierischen Protokolle wurden von den institutionellen Animal Care und Use Committee an der Oregon Health & Science University genehmigt.
1. Induktion von Entzündungen und FITC Malerei der Maus Pinna
<ol><li>In einem Laminar-Flow-Haube, betäuben Mausklick C57Bl/6 mit verdampftem Isofluorane (bei 3-5 % Isofluorane induzieren und pflegen auf 1-3 % Isofluorane; Sauerstoff Durchflussmenge bei 0,5-1,0 L/min). Richtige Anesthetization zu gewährleisten, durch die Überwachung des Verlust Ped...

Obwohl der Leukozyten Egress von peripheren, nicht-lymphatischen Geweben für die Initiierung und Auflösung der Immunantwort ankommt, sind die molekularen Mechanismen, die ausgehenden Regeln kaum erforscht. Diese Wissenslücke ist vor allem auf hohe Verfügbarkeit von Werkzeugen für die Quantifizierung in Vivo. Hier beschreiben wir die Verwendung von Photoconvertible Mäusen (Kaede-Tg) zu quantifizieren endogenen Leukozyten Austritt aus der Haut und Tumoren eine direkte Direktvergleich mit FITC-Lack in entzün...

Periphere Gewebe Immunantworten sind geprägt durch Leukozyten Einstellung zu den Standorten von Entzündungen, sondern auch durch Mechanismen, die ihre spätere Aufbewahrung zu Regeln. Somit richtet sich schützende Immunität durch kumulative zellulären und molekularen Mechanismen, die bestimmen, ob ein Leukozyten eingibt, Aufenthalte innerhalb, oder besser gesagt aus peripheren Gewebe über Lymphgefäße migriert. Wichtig ist, ist die Neigung für Leukozyten Gewebe durch Lymphgefäße (genannt Egress) beenden ihre speziellen Funktionen verbunden. Dendritische Zellen (DC) erwerben Wanderungsverhalten in Reaktion auf Reifung Signale führt zu Antigen-Transport und Präsentation in Entleerung Lymphknoten (dLN), ein Prozess, der für adaptive Immunität1erforderlich ist. Aufräumvorgang myeloische Zellen wie Makrophagen und Neutrophilen, dienen der Apoptotic Rückstand durch Phagozytose zu löschen. Während der bakteriellen Infektion Neutrophilen Brandschutzzeichen Gewebe und letztlich Apoptose in dLNs2 und in einem Modell der DSS-induzierte Kolitis, Daten unterstützen die Hypothese, dass Makrophagen Egress lokale Entzündung3lösen muss. Ob Neutrophilen und Makrophagen Egress Auftritt in allen entzündlichen zusammenhängen, ist allerdings unbekannt. Beweise für die T-Lymphozyten Egress von Steady-State4,5,6,7, infizierte8und entzündeten4,9,10, 11,12 periphere, nicht-lymphatischen Gewebe zeigt, dass T-Zellen aktiv umwälzen, obwohl die gewebebasierten Signale, die diese Ausfahrt fahren schlecht verständlich bleiben. Mehrere Studien identifizierten Signale für gerichtete Migration in Richtung Entwässerung lymphatische Kapillaren und die anschließende Brandschutzzeichen einschließlich Chemokin (C-C-Motiv) Liganden 21 (CCL21) und seines Rezeptors CCR74,11, 13, Chemokin (C-X-C Motiv) Liganden 12 (CXCL12) und sein Rezeptor CXCR42,14, sowie Sphingosine-1-Phosphat (S1P)10,15,16. Diese Mechanismen sind nicht in allen Kontexten tätig, und ob sie Ausgang alle Zelltypen bestimmen, bleibt eine offene Frage. Wichtig ist, bedarf weiterer Einblick in die Mechanismen, die für Ausstieg und seine funktionelle Relevanz bei der Krankheit gelten quantitative in-Vivo -Methoden der Analyse.
Verschiedene Methoden wurden verwendet, um Ausstieg in mehreren Tiermodellen in Vivo einschließlich direkter Kanülierung der Lymphgefäße, Adoptiv Transfer von ex-Vivo mit der Bezeichnung Leukozyten, transdermale Anwendung von fluoreszierenden Tracer zu quantifizieren, Einspritzung der beschriftete Partikel und in Vivo Ladungszustand17,18. Direkte Kanülierung der afferenten Maus Lymphgefäße ist schwierig und Kleintiere begrenzt durch die Menge an Flüssigkeit, die gesammelt werden können. So Kanülierung vor allem bei großen Tieren durchgeführt wurde (zB., Schafe) wo solche chirurgischen Manipulationen sind praktisch. Diese Studien liefern direkte Hinweise auf das Vorhandensein des lymphatischen und myeloischen Zellen in Lymphknoten10,19,20. Darüber hinaus zeigen Schafe Modelle, dass akute und chronische Entzündungen Lymphozyten Präsenz in Lymphe durch fast 100-fold10,21 erhöht.
Adoptiveltern Übertragung von beschrifteten und genetisch manipulierter Lymphozyten hat vor allem ergeben, dass CCR7 für den Ausstieg von CD4 benötigt+ T-Zellen von akut entzündeten Haut5,11, während der Vorbehandlung von Lymphozyten mit dem kleinen Molekül S1P-Rezeptor-Agonist hemmt FTY720, nur teilweise ihren Ausgang10. Interessanterweise der Egress von übertragenen Lymphozyten von chronisch entzündete Haut ist CCR7-unabhängige10, aber erfordern teilweise CXCR49. Adoptiv-Transfer Experimente, liefern jedoch physiologisch Zahlen von Ex-Vivo aktivierte und beschriftete Lymphozyten in das Gewebe durch Injektion, die biomechanische Umwelt von Geweben und erhöhten interstitiellen Fluiddrücke verändert das erste lymphatische Kapillaren öffnen und ändern ihre Transport-Eigenschaften-22. Als alternative, transdermale Anwendung von Fluorescein erfolgt (FITC) in das Vorhandensein oder Fehlen von dermalen Reizstoffe (zB., Dibutyl Phthalat, DBP) oder Infektion23,24 ermöglicht die Verfolgung von phagocytic Zellen, die Tracer zu sammeln und zu dLNs migrieren. In ähnlicher Weise können Eindringmittel beschriftete Tumoren phagocytic Zellen zu verfolgen, die Tumor Material25verschlungen haben. Diese Methoden haben wichtige Einblicke in die Mechanismen zur Verfügung gestellt, die regieren DC Ausgang13,14,17,26,27 , aber sind nicht in der Lage, nicht-phagocytic verfolgen Lymphozyten und Interpretation können durch kostenlose Lymphdrainage des löslichen FITC so Kennzeichnung nicht migrierend LN ansässige DCs erschwert werden.
Alternativ ist intravitalen Mikroskopie ein leistungsfähiges Werkzeug, das in Vivo Verfolgung von physiologisch relevanten Leukozyten Populationen in Echtzeit28,29ermöglicht. In Kombination mit dem Reporter Mäuse und Antikörper-basierten in Vivo immunofluorescent Kennzeichnung intravitalen Mikroskopie ergab die komplexe räumliche und zeitliche Dynamik der immunen Zellen des Drogenhandels, einschließlich interstitielle Migration30 , Seelenwanderung über das lymphatische Endothel, Passage innerhalb der lymphatischen Lumen und Migration auf LN Eintrag28,31. Breite Akzeptanz der intravitalen bildgebenden Verfahren wird durch Kosten, notwendige Know-how zum Einrichten, begrenzt und beschränkt Durchsatz zur Quantifizierung der mehrere Zelltypen. Dennoch werden Kupplung quantitative Methoden, die Populationsdynamik analysieren Gewebe mit intravitalen Bildgebung zusätzliche und wichtige mechanistischen in Bezug auf die Mechanismen der Motilität und Migration in Richtung und im lymphatischen Kapillaren Einblick 18 , 31 , 32.
Infolgedessen in Vivo Ladungszustand entstanden als eine Methode, die in Situ zu etikettieren, erlaubt unabhängig von phagocytic Tätigkeit und für die Quantifizierung der physiologischen Leukozyten Ausgang (wenn in Verbindung mit Durchflusszytometrie) in der fehlen oder Vorhandensein von Herausforderung. Kaede-Tg Mäuse express konstitutiv ein Protein isoliert von Stony Coral, die grüne Fluoreszenz (Kaede grün) aufweist, bis UV-Licht ausgesetzt nach denen es irreversibel zu rote Fluoreszenz (Kaede rot)33umwandelt. Photoconverted Zellen können verfolgt werden, wie sie von Seiten der peripheren Gewebe Brandschutzzeichen und reichern sich in dLNs. Dies und andere ähnliche Photoconvertible Maus Modelle34,35 ergaben sich wichtige Biologie einschließlich konstitutive Egress von regulatorischen T-Zellen von Haut36, CXCR4-abhängige B Zelle Austritt von Peyer Patches37 , Mobilisierung von Residenten Speicher T-Zellen auf Peptid erneut herausfordern38und breiten Leukozyten Egress von Tumor Mikroumgebungen39. Hier führen wir einen direkten Vergleich der Ladungszustand mit transdermalen FITC Anwendung im Rahmen der kutanen Entzündung und Infektion mit der Photoconvertible-Methode zum direkten Vergleich der vorhandenen Daten zu ermöglichen. Wir zeigen Ladungszustand im implantierten Tumoren und beschreiben die Umwandlungs-Leistungsfähigkeit und selektive Egress von Tumor Mikroumgebungen. So, wir argumentieren, dass die weitere Anwendung dieser Methoden benötigt wird, um die kritische Biologie der Leukozyten Egress von Tumoren, aufzuklären, die erhebliche Auswirkungen auf die Interpretation intratumorale Leukozyten Komplexität, anti-Tumor Immunität haben wird und Ansprechen auf die Therapie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4536282001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor</td>
			<td>Prizmatix Ltd</td>
			<td>V8144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibutyl phthalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>524980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>2440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29-guage syringes</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 um cell strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>HBL06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>70-0161-M001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605 CD11c (clone N418)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>562363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 CD3e (clone 145-2C11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC CD8a (clone 53-6.7)</td>
			<td>TonBo Biosciences</td>
			<td>20-0081-u100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV650 CD19 (clone 6D5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 CD11b (clone M1/70)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605 CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 CD4 (clone RM4-5)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (Fraction V)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fortessa Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying leukocyte egress via lymphatic vessels from murine skin and tumors

Leukozyten-Ausstieg aus den peripheren Geweben, Lymphknoten ist nicht nur wichtig für die Immunüberwachung und Einleitung, sondern trägt auch zur Lösung der peripheren Gewebe Antworten. Während eine Vielzahl von Methoden werden verwendet, um die Leukozyten Ausstieg aus den nicht-lymphatischen, peripheren Geweben zu quantifizieren, bleiben die zellulären und molekularen Mechanismen, die Kontext-abhängige ausgehenden Regeln schlecht verstanden. Hier beschreiben wir die Verwendung von in Situ Ladungszustand für Quantitative Analyse der Leukozyten Ausstieg aus murinen Haut und Tumoren. Ladungszustand ermöglicht die direkte Kennzeichnung von Leukozyten in Hautgewebe aufhalten. Obwohl die Exposition der Haut gegenüber UV-Licht induziert lokale Entzündungsreaktionen Leukozyten Infiltrate und geprägt vaskulären Undichtigkeit in einem Direktvergleich mit transdermalen Anwendung von fluoreszierenden Tracern Ladungszustand speziell wandernde dendritische Zellenbevölkerungen beschriftet und aktiviert gleichzeitig die Quantifizierung der myeloischen und lymphatischen Egress von kutanen Mikroumgebungen und Tumoren. Die Mechanismen der Leukozyten Egress bleiben eine fehlende Komponente in unserem Verständnis der intratumorale Leukozyten Komplexität und damit die Anwendung der hier beschriebenen Tools bieten einzigartige Einblicke in die Dynamik der Tumor immun Mikroumgebungen beide im Steady State und im Ansprechen auf die Therapie.

Zuerst wollten wir replizieren Ladungszustand Ergebnisse veröffentlicht in der Literatur zu bewerten die Effizienz und die damit verbundenen Entzündung in der Maus Haut festzulegen. Der Ohr-Pinna 100 mW UV-Licht ausgesetzt war (405 nm) für 3 min33wie zuvor beschrieben. Einzelne Zellsuspensionen generiert aus dem Ohr Haut oder zervikalen dLNs unmittelbar nach der Exposition einen 78 % Wirkungsgrad von allen CD45 offenbart+ Leukozyten in der Haut mit ke...

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Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Hier zeigen wir die Methoden zur in Vivo Quantifizierung der Leukozyten Ausstieg aus naiv, entzündet, und bösartigen murinen Haut. Wir führen einen direkten Vergleich der beiden Modelle: transdermale FITC Anwendung und in Situ Ladungszustand. Darüber hinaus zeigen wir den Nutzen der Ladungszustand für die Verfolgung von Leukozyten Egress von kutanen Tumoren.

Quantifizierung der Leukozyten Egress über Lymphgefäße aus murinen Haut und Tumoren

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

Photoconversion bietet eine nachvollziehbare In-vivo-Methode für die quantitative Analyse von Leukozyten-Egress für einen mechanistischen Einblick in Leukozyten-Residenz und Exit-Dynamik von mehreren Gewebestandorten in krankheitskranken Zuständen. Nun, hier zeigen wir den Nutzen der Leukozytenverfolgung von Hauttumoren. Die Anwendung dieses Assays auf andere Gewebe und Krankheiten ist nur durch die Fähigkeit zur Verabreichung von Licht begrenzt.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, die Quantifizierung endogener statt übertragener Immunzellpopulationen als Folge von entzündeten Geweben in vivo zu ermöglichen. Um Entzündungen zu induzieren, nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, verwenden Sie eine Mikropipette, um 20 Mikroliter Dibutylphthalat oder DBP zu verabreichen, auf die ventrale Seite der Ohrpinna einer anästhesierten Kaede transgene Maus. Nachdem Sie das DBP trocknen lassen, ziehen Sie das Ohr durch einen Schlitz in einem Stück Aluminiumfolie und verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um das Ohr flach an der Folie mit der dorsalen Seite nach oben zu befestigen.Positionieren Sie dann, dass Sie sich direkt unter einer 405 Nanometer Lichtquelle befinden, und fotokonvertieren für drei Minuten bei 100 Milliwatt Leistung. Bei einer Impfung verwenden Sie eine Mikropipette, um 5 mal 10 bis zur 6. Plaque bildenden Einheiten des Impfvirus in 10 Mikroliter PBS auf die Ohrpinna einer anästhesierten Kaede transgene Maus zu verabreichen und die Pinna 25 Mal zu stochern. 24 Stunden später, Photoconvert die Pinna, wie gerade gezeigt.Zum entsprechenden experimentellen Zeitpunkt ernten Sie die Pinnae und die zervikalen und leistenden Lymphknoten und verwenden Sie zwei Pinzettenpaare, um die ventrale und dorsale Seite jeder Pinna auseinander zu schälen. Dann legen Sie die Lymphknoten und die Pinna-Stücke, mit der Innenseite des Ohres nach unten, in einzelne Brunnen einer 24-Well-Platte mit 1 Milligramm pro Milliliter Kollagenase D und 80 Einheiten pro Milliliter Dnase in HBSS mit Kalzium und Magnesium verdünnt. Verwenden Sie zwei 29-Meter-Nadeln, um jede Lymphknotenkapsel zu necken und die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius zu platzieren.Am Ende der Inkubation drücken Sie die verdauten Pinna und Lymphknotengewebe durch separate 70 Micron Nylon-Zell-Siebe, um einzellige Suspensionen jedes Gewebes zu erhalten. Wenn die Tumoren auf die entsprechende experimentelle Größe angewachsen sind, rasieren Sie jedes neu nachgewachsene Fell um die Tumorstelle und ziehen Sie den Tumor durch ein kreisförmiges Loch, das in ein Stück Aluminiumfolie geschnitten ist. Positionieren Sie den Tumor direkt unter der 405 Nanometer Lichtquelle und photoconvert für 5 Minuten bei 200 Milliwatt Leistung.24 Stunden nach der Photokonversion ernten Sie die Tumore und brachialen und leistenden Lymphknoten von jedem Tier und verwenden Sie eine Schere, um die Tumore in einzelnen Brunnen einer 24-Well-Platte mit Collagenase D und DNase in HBSS zu zerkleinern. Legen Sie die Lymphknoten in separate Brunnen und necken Sie die Kapseln, wie gerade gezeigt. Nachdem Sie die Tumore für eine Stunde und die Lymphknoten für eine halbe Stunde bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, drücken Sie das verdaute Gewebe durch separate 70 Micron-Siebe, um einzellige Suspensionen jedes Gewebes zu erhalten.Um die einzelzelligen Suspensionen durch Durchflusszytometrie zu analysieren, sammeln Sie zuerst die Milz oder das Blut von einer Kaede transgene Maus und lyse die roten Blutkörperchen mit Ammoniumchlorid Kaliumpuffer. Teilen Sie die Zellen in eine unkonvertierte Kaede FITC und eine konvertierte Kaede PE-Population und setzen Sie die einfarbigen Kaede PE-Zellen in einem Milliliter PBS in einem Brunnen einer 24-Well-Platte wieder auf, und dann die Zellen für 5 Minuten unter einer 405 Nanometer Lichtquelle bei 100 Milliwatt Leistung fotoconvert. Verwenden Sie anschließend die fotokonvertierten Kaede PE-Zellen und die nicht konvertierten Kaede FITC-Zellen, um die Photomultiplierspannungen auf 70 bis 80 % des Gesamtbereichs jedes Fluoreszenzkanals einzustellen.Sobald die Spannungen für die Kaede-Proteine eingestellt sind, kompensieren Sie alle anderen primären Antikörperflecken mit einzelnen Fluorophor-markierten Kompensationsperlen, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie dann die Proben auf dem Durchflusszytometer gemäß den standardmäßigen zytometrischen Analyseprotokollen durch. Einzelzellige Suspensionen, die unmittelbar nach der Photokonversion von der Ohrhaut oder den zervikal entwässernden Lymphknoten erzeugt werden, zeigen eine 78%ige Umwandlungseffizienz aller CD45-positiven Leukozyten in der Haut, ohne dass konvertierte Zellen in den entwässernden Lymphknoten beobachtet werden.Die Quantifizierung der Anzahl der infiltrierenden CD45-positiven Leukozyten in fotokonvertierten Ohren Null und 24 Stunden nach der Umwandlung zeigt, dass die violette Lichtexposition eine statistisch signifikante Zunahme der Leukozyteninfiltration verursacht. Dieser Anstieg der CD45-positiven Leukozyteninfiltration ist jedoch im Vergleich zur Infiltration, die durch einen starken entzündungshemmenden Reiz wie das Impfvirus induziert wird, gering. Photokonversion erhöht auch die vaskuläre Permeaität in der Ohrpinne, gemessen durch Miles Assay, zusammen mit dem Hinweis, dass Die Auswirkungen von violettem Licht auf Gewebeentzündungen bei der Optimierung von Dosis, Expositionszeit und Dateninterpretation berücksichtigt werden sollten.Die zytometrische Analyse von dissoziierten Tumorzellen von fotokonvertierten Tieren zeigt eine signifikante Umwandlung intratumoraler CD45-positiver Zellen von Kaede FITC-positiv in Kaede PE-positiv, während die Entwässerung von Lymphknotenzellen unkonvertiert bleibt. Die Photokonversionseffizienz von CD45-positiven Leukozyten variierte signifikant zwischen Tumortypen und -größen, wobei CD45-positive Leukozyten bei kleinen Melanomtumoren die effizienteste Photokonversion demonstrierten. Mit zunehmendem Tumorvolumen nimmt die Umwandlungseffizienz auf rund 50% ab. Melanin hat einen auffälligen Einfluss auf die Photokonversionseffizienz mit einer maximalen Photokonvertierung von CD45-positiven Zellen, die bei Melanin produzierenden Tumoren von nur etwa 30% bei kleineren Tumoren beobachtet werden, die auf 10% sinkt, wenn sich das Tumorvolumen 400 Kubikmillimeter nähert.Die Untersuchung von tumorentwässernden Lymphknoten 24 Stunden nach der Photokonversion zeigt das Vorhandensein von Kaede roten positiven Immunzellen verschiedener Phänotypen und zeigt damit die Auswanderung von Leukozyten aus dem photokonvertierten Tumor. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um die Kinetik des stationären Zustands und des entzündeten Leukozytenumsatzes im peripheren Gewebe aufzudecken. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass nur das Gewebe von Interesse fotokonvertiert ist, da unbeabsichtigte Photokonvertierung des umgebenden Gewebes Ihre Ergebnisse beeinträchtigt.Personen, die neu bei dieser Methode sind, sollten die Expositionszeit für die Umwandlung ihres Gewebes sowie die Dauer der Zeit vor der Gewebeentnahme auf der Grundlage der Dynamik von Leukozyten von Interesse optimieren.

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Skin Transplantation

Murine Hauttransplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to ...

Forschung

Biologie

Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

Die Analyse der physiologischen E-Selectin-vermittelte Leukozyten-Rolling auf mikrovaskuläre Endothel

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolierung von Immunzellen aus Primärtumoren

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enrichment durch eine Transposase-basierte Technologie für NGS-Analyse der gesamten Sequenz von<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt; Und 9 Gene in der DNA-Reparatur beteiligt Schäden

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen und Makrophagen

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Ein murines Modell einer Verbranntenwunde, rekonstruiert mit einem allogenen Hautgraft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Hemmung der Wundepidermisbildung durch vollständige Hautlappenchirurgie während der Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...