Name: establishing cell lines overexpressing dr3 to assess the apoptotic response to anti-mitotic therapeutics
Uploaded: 2019-01-11T15:00:00
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这项工作得到了清华大学 531000117 (致 g. w.) 和 043222019 (至 x. w.) 赠款的支持。

请注意, 此处描述的所有鼠标实验均已根据清华大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 获得批准并进行。
1. dr3 多表达细胞系的生成
<ol><li>通过在 c 期终止点将带有 3x flag 的全长 dr3 cdna 插入 bshi/xhoi 限制地点的 vmxs-ires-blastisistiin 中, 构建 dr3 表达的质粒。</li>
	<li>在60毫米的盘子里生长 plat-a 细胞, 其中含有4毫升的 dulbecco 的改性鹰培养基 (dmem)。第二天, 当细胞达到 80%-90% 的融合...

<ol>
	<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Recillas-Targa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+for+gene+transfer,+expression,+knockdown,+and+chromatin+influence+in+mammalian+cell+lines+and+transgenic+animals.">Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals.</a> Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).</li><li>Daley, G. 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The New England.</a> Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).</li><li>Roesler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-generation,+self-inactivating+gp91(phox)+lentivector+corrects+the+oxidase+defect+in+NOD/SCID+mouse-repopulating+peripheral+blood-mobilized+CD34++cells+from+patients+with+X-linked+chronic+granulomatous+disease.">Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease.</a> Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).</li><li>Russell, W. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeted+anticancer+agents+and+apoptosis.">Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis.</a> Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).</li><li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs.">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li><li>Bhat, K. M., Setaluri, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-associated+proteins+as+targets+in+cancer+chemotherapy.">Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).</li><li>Bates, D., Eastman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+destabilising+agents:+far+more+than+just+antimitotic+anticancer+drugs.">Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).</li><li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-mitotic+chemotherapeutics+promote+apoptosis+through+TL1A-activated+death+receptor+3+in+cancer+cells.">Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells.</a> Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).</li><li>Marsters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apo-3,+a+new+member+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family,+contains+a+death+domain+and+activates+apoptosis+and+NF-kappa+B.">Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B.</a> Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).</li><li>Chinnaiyan, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+by+DR3,+a+death+domain-containing+receptor+related+to+TNFR-1+and+CD95.">Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95.</a> Science. 274 (5289), 990-992 (1996).</li><li>Xu, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+receptor+3+mediates+TNFSF15-+and+TNFalpha-induced+endothelial+cell+apoptosis.">Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 55, 109-118 (2014).</li><li>Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TL1A-induced+NF-kappaB+activation+and+c-IAP2+production+prevent+DR3-mediated+apoptosis+in+TF-1+cells.">TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).</li><li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+of+TWEAK-induced+cell+death.">Multiple pathways of TWEAK-induced cell death.</a> Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning:+powerful+tools+in+functional+genomics.">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li><li>Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazonamide+toxins+reveal+an+unexpected+function+for+ornithine+delta-amino+transferase+in+mitotic+cell+division.">Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).</li><li>Hassan, M. S., von Holzen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Model:+Xenograft+Mouse+Models+in+Esophageal+Adenocarcinoma.">Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma.</a> Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).</li><li>Potter, H., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+by+electroporation.">Transfection by electroporation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effects+of+transfection:+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells.">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).</li><li>Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+responses+in+the+HeLa+proteome+subsequent+to+transient+plasmid-mediated+transfection.">Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).</li><li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+the+toxicogenomics+and+the+genotoxic+potential+of+a+cationic+lipid-based+gene+delivery+nanosystem+in+human+alveolar+epithelial+a549+cells.">Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).</li></ol>

在这篇手稿中, 我们描述了一种方法, 以生成 ht29-dr3 稳定的细胞系。ht29-dr3 细胞为研究 dr3 促进抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡的分子机制提供了一个模型。这种方法是通用和可重复的。为确保该程序的成功, 需要考虑议定书的四个关键步骤。首先, 为了产生足够高的病毒滴度, 建议在 plat-a 细胞达到 80%-90% 汇合时进行 dna 转染。其次, 病毒悬浮液应在4°c 下储存不超过 2周, 从光线下覆盖。第三, 当将受感?...

异源基因表达经常被用来研究感兴趣的基因的功能。在细胞和分子生物学中, 有两种方法, 即瞬态转染和稳定转染, 将一段 dna 或 rna 插入宿主细胞1,2。短暂转染的 dna 或 rna 不能传递给子细胞, 因此基因改变只能保留很短的时间。另一方面, 在稳定转染的细胞中, 外源基因被整合到宿主细胞基因组中, 维持其在细胞系中的表达。因此, 稳定转染是一种通常保留用于长期遗传调控研究的方法。稳定的细胞系也可以作为异种移植移植到小鼠模型中进行体内研究3。稳定转染可分为两类: 病毒转染和非病毒转染。与非病毒转染相比, 病毒感染可以将基因转移到更广泛的人类细胞中, 效率更高的是4、5、6、7。此外, 来自单个克隆的稳定细胞系具有均匀性和克隆纯度的优势。
不受控制的细胞生长和分裂是癌症最显著的特征。在临床环境中, 抗肿瘤药物是许多类型肿瘤的主要治疗方法8。然而, 抗肿瘤药物的一些重大限制不容忽视。首先, 这些化疗也会杀死正常细胞和不想要的癌细胞, 从而导致严重的副作用 8.其次, 抗管蛋白药物并不能有效对抗所有类型的肿瘤, 尽管管蛋白在各种不同的组织中无处不在, 作为细胞骨架蛋白9,10.目前尚不清楚为什么抗管蛋白药物在临床治疗中对卵巢癌、肺癌和血癌表现出很有希望的疗效, 但在肾癌、结肠癌或胰腺癌中却没有。最后, 即使是同类型肿瘤患者, 对抗肿瘤药物的反应也会有所不同, 无法预测。可能有一个关键的效应分子, 影响不同患者对抗肿瘤药物的敏感性, 导致在临床治疗中看到的各种结果12。因此, 应考虑患者对抗肿瘤治疗的潜在差异敏感性, 以优化治疗干预13。
高通量全基因组 sirna 文库屏幕表明, dr3 击倒可使敏感细胞对抗肿瘤药物产生耐药性, 并暗示 dr3 在化疗诱导的细胞凋亡中的作用14。作为肿瘤坏死因子受体 (tnfr) 超家族的成员, dr3 已被报道在不同系统中介导细胞凋亡15、16、17、18.因此, 我们着手建立稳定的细胞系过度表达 dr3, 研究分子机制, 其中抗肿瘤药物诱导细胞凋亡。人类结肠癌细胞线 ht29 可以提供一个合适的细胞模型来研究 dr3 过度表达, 该细胞系被发现缺乏 dr3。此外, 在诊所, 结肠癌对抗炎药物不敏感 19.
在本文中, 我们描述了一种方法, 允许产生 ht29-dr3 稳定的细胞系通过逆转录病毒感染。我们进一步展示了如何使用西方印迹验证这些细胞中的 dr3 表达, 以及如何通过使用细胞活力分析和形态学观察来评估对抗结核药物的敏感性。细胞从单个克隆体中被扩增, 因此具有均匀遗传背景的优势。此外, dr3 上的 flag 标签允许通过显微镜对细胞 dr3 进行可视化, 并通过生化方法分析基因表达和蛋白质相互作用。此外, 这些细胞可以在小鼠体内进行异种移植, 以进一步分析肿瘤的进展, 以应对体内14的抗肿瘤药物。
这里介绍的 ht29-dr3 细胞系统为研究抗肿瘤药物如何杀死癌细胞的分子机制提供了一个有效的工具。由于过度表达和击倒细胞系是研究基因功能的常用工具, 该协议可以很容易地适应其他感兴趣的基因或其他细胞系, 从而转化为一种广泛使用的方法。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C11965500BT</td>
			<td>Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMXs-IRES-Blasicidin</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RTV-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14190500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse secondary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT29 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plat-A cell line</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning Cylinder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT3MV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX53 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plates</td>
			<td>Nest</td>
			<td>712001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture plates</td>
			<td>Nest</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m steril filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well White Polystyrene Microplate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western ECL Substrate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>ImageQuant LAS 4000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decoloring Shaker&#160;</td>
			<td>HINOTECH</td>
			<td>TS-2000A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-bl-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>TC 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing cell lines overexpressing dr3 to assess the apoptotic response to anti-mitotic therapeutics

研究感兴趣的基因的功能可以通过操纵其表达水平来实现, 比如通过击倒细胞系降低其表达, 或者通过过度表达细胞系增加其表达。瞬态转染和稳定转染是外源基因表达常用的两种方法。瞬态转染只对短期表达有用, 而稳定转染则允许外源基因整合到宿主细胞基因组中, 在那里它将被连续表达。因此, 稳定转染通常被用于长期遗传调控的研究。在这里, 我们描述了一个简单的协议, 以产生一个稳定的细胞系过度表达标记死亡受体 3 (dr3), 以探索 dr3 功能。我们在抗逆转录病毒感染后选择单克隆, 以保持稳定细胞系的同质性和纯度。使用该协议生成的稳定细胞系使 dr3 缺乏的 ht29 细胞对抗炎药物敏感, 从而重组 ht29 细胞的凋亡反应。此外, dr3 上的 flag 标记补偿了良好 dr3 抗体的不足, 并促进了抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的分子机制的生化研究。

图 1显示了稳定表达 dr3 的 ht29 细胞的特性。克隆表达不同程度的 dr3, 而野生类型细胞, 作为一个负面的控制, 不显示外源基因表达。在这里, 我们只显示五个克隆, 其中克隆1和5表示 dr3 的最高级别。我们选择克隆1和克隆5进行以下实验。
在图 2中, 用倒置显微镜在10倍放大倍率下观察?...

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Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

建立过度表达 dr3 的细胞系, 评估抗有丝分裂治疗的凋亡反应

建立一个稳定的细胞系, 过度表达一个有兴趣的基因, 研究基因功能, 可以通过稳定的转化后, 选择单一克隆通过逆转录病毒感染后。在这里, 我们表明, ht29-dr3 细胞系产生这种方式阐明的机制, 死亡受体 3 (dr3) 有助于抗肿瘤诱导的细胞凋亡。

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

细胞中基因的表达是研究基因功能的重要方法。逆转录病毒的稳定转染使内源基因能够整合到宿主基因组中并持续表达。我们拿起逆转录病毒感染的单菌落，并生成稳定的细胞系过度表达 FLAG 标记的 DR3。细胞系弥补了良好的 DR3 抗体的不可用性，并为体外和体内的 DR3 功能研究提供了出色的工具。我们通过拾取一个逆转录病毒感染的群体生成了 DR3 过度表达细胞系。来自单个菌落的细胞系可以保持同质性和纯度。此外，该协议易于处理。为了开始这个程序，在60毫米的盘子中用4毫升DMEM一夜之间种植板-A细胞。当细胞达到80至90%汇合时，使用转染试剂用制造商手册中概述的两微克的构造质粒进行转染。72小时后，收集上经剂。使用0.45微米无菌过滤器，过滤介质，使病毒悬浮液在黑暗中保持4摄氏度。接下来，用DMEM在60毫米的培养皿中隔夜生长HT29细胞，用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞。当细胞达到30-50%的汇合，感染他们两毫升的病毒悬浮液，在8微克的多布雷尼每毫升病毒悬浮液的存在。在37摄氏度下孵育受感染的细胞4至6小时。然后，吸病毒悬浮液。加入四毫升新鲜DMEM，并将菜回孵化器。感染后24小时，从盘子中取下介质，用两毫升预热PBS小心清洗细胞。加入一毫升的尝试性EDTA，并在37摄氏度下孵育细胞3分钟。使用显微镜放大10倍，观察细胞，以确保它们中的大多数已经分离。在此之后，加入两毫升含有10%FBS的DMEM，以停止三辛化，并在15毫升管中收集细胞悬浮液。在室温下以200倍g离心5分钟，取出上一代。将细胞颗粒重新悬浮在 10 毫升 DMEM 中，然后轻轻上下移液器混合。接下来，用30、100和300因子稀释细胞。种子细胞是150毫米的盘子，每个含有20毫升DMEM含有爆炸素，浓度为每毫升1微克。在37摄氏度下孵育，用5%的二氧化碳孵育约一至两周。在此期间，使用放大倍数10倍的倒置显微镜每天观察菌落。当菌落的直径约为一到两毫米时，标记菜底上分离良好的菌落。当潜伏期结束时，吸气介质，用三毫升预热PBS清洗细胞。在60毫米的菜中加入两毫升的尝试素EDTA。使用无菌钳子拾取自检的无菌克隆瓶，并把它们放在培养皿中。然后，拿起圆柱体，现在每个都含有约30微升的三角素EDTA，并轻轻地把它们放在标记的殖民地。将菜返回孵化器三分钟。在此之后，在显微镜下检查细胞，以确保它们已分离。当细胞提升时，在70微升的培养介质到每个圆柱体，以灭活的三平素。使用 200 微升移液器轻轻混合电池悬架，确保混合时不要移动气缸。设置两个24孔板，并标记他们板 A 和板 B. 添加一毫升 DMEM 到每个孔.在板 A 的每个孔中加入 30 微升的细胞悬浮液，并在板 B 的相应孔中加入 70 微升。当板 B 中的细胞处于 90% 汇合时，取出介质，用一毫升 PBS 小心地清洗细胞。完全删除 PBS，并添加 50 微升 1X SDS-PAGE 加载缓冲液来对细胞进行切片。五分钟后，将细胞酸盐从24井板转移到1.5毫升离心管。将样品在100摄氏度下煮10分钟。在 10%SDS 凝胶上以 80 伏的恒定电压运行样品 15 分钟，然后在 120 伏特下运行 1 小时。然后以400毫安的恒定电流湿转至聚乙烯氟化物膜，持续两小时。在溶解在TBST中的5%脱脂牛奶中，将原抗体稀释5000倍。将 FLAG 抗体加入膜中，并在四摄氏度下孵育过夜。使用设置为 200 RPM 的脱色摇床，用 TBST 清洗膜 15 分钟，每五分钟刷新一次 TBST。然后，在5%脱脂牛奶中稀释抗小鼠二级抗体1万倍。用稀释的二次抗体在四摄氏度下孵育膜五至六个小时。如前所述，再次清洗脱色摇床上的膜。在此之后，使用西方增强的化学发光和凝胶文档系统来成像膜并检测 FLAG 表达。首先，通过三位化收集HT29和HT29-DR3细胞，并使用自动细胞计数器测量细胞密度。用DMEM将细胞播种到12孔板的井中，每孔密度为3万个细胞，并在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育过夜。第二天，在每孔中加入10纳米的二氮酰胺，该井含有1%DMSO的细胞作为负对，并将板转移到37摄氏度的培养箱中，用5%的二氧化碳。经过48小时的治疗，在显微镜下以10倍的放大倍率对细胞进行成像。接下来，将HT29和HT29-DR3细胞种子到96孔板的井中，每孔3000个细胞的密度为DMEM，并允许它们一夜之间在37摄氏度下生长。第二天，添加文本协议中概述的剂量升级的二甲酰胺浓度。经过48小时的治疗，使用基于发光的细胞活力测定试剂盒测量细胞的生存能力。从培养箱中取出 96 井板，让它在室温下站立约 30 分钟。然后，在每一个井中加入50微升的检测试剂，并在室温下摇动板两分钟，以糖细胞。在室温下孵育板10分钟，然后使用微孔板读卡器确定每孔的亮度。HT29细胞稳定表达 DR3 的特征显示，克隆表达不同级别的 DR3，而野生细胞不显示外源基因表达。基因一和五被看到表达最高水平的 DR3，因此被选择进行进一步的实验。HT29和HT29-DR3细胞的形态在用二甲酰胺治疗48小时后被观察。HT29-DR3细胞显示明显的凋亡与破碎的细胞膜和细胞碎片。然而，HT29细胞只显示线粒体逮捕与完整的细胞，表现出一个四舍五入的细胞形状。这些细胞类型的细胞生存能力，然后确定后，治疗48小时与三纳米摩尔酰胺。HT29-DR3细胞的细胞死亡率超过80%，而亲的HT29细胞只表现出线粒体逮捕形式的轻微反应。这表明，DR3的超表达重组了这些细胞中由二甲酰胺诱导的凋亡通路。适当的串行稀释对于获得单克隆的最佳密度非常重要。同样重要的是，确保每个克隆圆柱体只包含一个菌落，并避免污染附近的菌落。DR3过度表达细胞系有助于体外分子机制的生化研究。通过HT29-DR3细胞的皮下注射，我们生成了HT29-DR3异种移植，帮助阐述了体内抗药剂诱导凋亡的机制。该协议可用于研究其他细胞系中感兴趣的基因。此外，基因敲解是功能研究的另一种方式，我们的协议可以适应基因敲除系统。因此，它一般适用于阐明基因功能。请记住将病毒中继器丢弃到特定容器中，以进行安全处理。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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科研

癌症研究

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