Name: establishing cell lines overexpressing dr3 to assess the apoptotic response to anti-mitotic therapeutics
Uploaded: 2019-01-11T15:00:00
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この作品は、(ギニアビサウ) に 53110000117 と清華大学から (X.W.) に 043222019 の補助金によって支えられました。

ここで説明したすべてのマウス実験が承認され、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 清華大学に従って実施されますのでご注意ください。
1. DR3 過剰発現細胞株の生成
<ol><li>3 DR3 cDNA を挿入することによって DR3 式 (pMXs IRES DR3 フラグ) のプラスミドを構築 retroviral ベクトルに対するブラストサイジン pMXs IRES 病原/XhoI の制限のサイトでに C 末端のフラグ x。</li>
	<li>ダル?...

<ol>
	<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Recillas-Targa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+for+gene+transfer,+expression,+knockdown,+and+chromatin+influence+in+mammalian+cell+lines+and+transgenic+animals.">Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals.</a> Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).</li><li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+BCR/ABL-induced+leukemias.">Animal models of BCR/ABL-induced leukemias.</a> Leukemia &amp; Lymphoma. 11, 57-60 (1993).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+correction+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+ex+vivo+gene+therapy.+The+New+England.">Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England.</a> Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).</li><li>Roesler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-generation,+self-inactivating+gp91(phox)+lentivector+corrects+the+oxidase+defect+in+NOD/SCID+mouse-repopulating+peripheral+blood-mobilized+CD34++cells+from+patients+with+X-linked+chronic+granulomatous+disease.">Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease.</a> Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).</li><li>Russell, W. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeted+anticancer+agents+and+apoptosis.">Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis.</a> Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).</li><li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs.">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li><li>Bhat, K. M., Setaluri, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-associated+proteins+as+targets+in+cancer+chemotherapy.">Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).</li><li>Bates, D., Eastman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+destabilising+agents:+far+more+than+just+antimitotic+anticancer+drugs.">Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).</li><li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-mitotic+chemotherapeutics+promote+apoptosis+through+TL1A-activated+death+receptor+3+in+cancer+cells.">Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells.</a> Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).</li><li>Marsters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apo-3,+a+new+member+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family,+contains+a+death+domain+and+activates+apoptosis+and+NF-kappa+B.">Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B.</a> Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).</li><li>Chinnaiyan, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+by+DR3,+a+death+domain-containing+receptor+related+to+TNFR-1+and+CD95.">Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95.</a> Science. 274 (5289), 990-992 (1996).</li><li>Xu, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+receptor+3+mediates+TNFSF15-+and+TNFalpha-induced+endothelial+cell+apoptosis.">Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 55, 109-118 (2014).</li><li>Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TL1A-induced+NF-kappaB+activation+and+c-IAP2+production+prevent+DR3-mediated+apoptosis+in+TF-1+cells.">TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).</li><li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+of+TWEAK-induced+cell+death.">Multiple pathways of TWEAK-induced cell death.</a> Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning:+powerful+tools+in+functional+genomics.">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li><li>Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazonamide+toxins+reveal+an+unexpected+function+for+ornithine+delta-amino+transferase+in+mitotic+cell+division.">Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).</li><li>Hassan, M. S., von Holzen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Model:+Xenograft+Mouse+Models+in+Esophageal+Adenocarcinoma.">Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma.</a> Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).</li><li>Potter, H., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+by+electroporation.">Transfection by electroporation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effects+of+transfection:+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells.">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).</li><li>Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+responses+in+the+HeLa+proteome+subsequent+to+transient+plasmid-mediated+transfection.">Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).</li><li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+the+toxicogenomics+and+the+genotoxic+potential+of+a+cationic+lipid-based+gene+delivery+nanosystem+in+human+alveolar+epithelial+a549+cells.">Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).</li></ol>

本稿では、HT29 DR3 安定したセルラインを生成する手法について述べる。DR3 HT29 細胞は、DR3 が体のエージェントによって誘導されるアポトーシスに貢献する分子機構を研究するためのモデルを提供します。このアプローチは、汎用性と再現性です。プロシージャの成功を確保するためプロトコルの 4 つのステップを考慮する必要があります。まず、高を生成するために十分なウイルスの力価は...

異種遺伝子発現されている興味のある遺伝子の機能を勉強する.2 つの方法、過渡と安定したトランスフェクション海抜ホスト セル1,2に DNA または RNA のセグメントを挿入する細胞および分子生物学で使用されます。一過性トランスフェクション DNA または RNA 渡すことができない娘細胞、遺伝子は短い期間だけ保持ことができますように。その一方で、固定して transfected セルで外因性の遺伝子は細胞株での発現を維持ホスト細胞のゲノムに統合されます。したがって、安定したトランスフェクションは、長期の遺伝的調節に関する研究の通常予約されている方法です。生体内でのマウス ・ モデルに異種移植片の研究3として、安定したセルラインを移植もことができます。安定したトランスフェクションは、2 つのカテゴリに分けることができます: ウイルスや nonviral。Nonviral 遺伝子導入と比較して、ウイルス感染は、幅広い高効率4,5,6,7で人間の細胞に遺伝子を転送できます。さらに、単一のクローンから安定したセルラインは均質性とクローンの純度の利点を提供しています。
抑制されない細胞の成長と分裂は、がんの最も顕著な特徴です。臨床設定では、体のエージェントは、腫瘍8の多くの種類のための主要な治療をします。しかし、体のエージェントのいくつかの重要な制限は無視できません。まず、これらの化学療法は望ましくないがん細胞とともに正常な細胞も殺すことができるし、したがって、ことが、重篤な副作用8で。第二に、医学: 抗チューブリンの薬はチューブリンのいたるところにある細胞骨格タンパク質9,10としてさまざまな異なったティッシュの表現にもかかわらず、腫瘍のすべてのタイプに対して有効ではありません。医学: 抗チューブリン エージェントに対して有望な効果を示したが理由は不明である卵巣、肺、血液癌臨床治療ではなく、腎臓、大腸、または膵癌11。最後に、同じ種類の腫瘍でも患者に応答できます、antimitotics 異なる予測不可能な方法で。キー エフェクター分子の臨床12に見られる多様な成果の結果、体のエージェントに別の患者の感受性に影響を与える可能性があります。したがって、治療13を最適化するために考慮患者を抗がん剤治療の潜在的な差動感度を撮影する必要があります。
高スループット全体ゲノム siRNA ライブラリ画面を示した DR3 ノックダウンが敏感な細胞における化学療法誘発アポトーシス14DR3 の役割を測定、抗がん剤の薬剤に対して抵抗力をレンダリング可能性があります。腫瘍壊死因子受容体 (TNFR) スーパーファミリーのメンバーとして様々 なシステム15,16,17,18細胞のアポトーシスを仲介する DR3 を報告されています。したがって、我々 は、抗がん剤の薬剤はアポトーシスを誘導する分子機構を研究する DR3 を過剰発現する安定したセルラインを確立に着手します。DR3 の過剰発現を研究するための適切な細胞モデルは、ひと大腸癌細胞株 HT29 DR3 欠損をすることが分かったによって提供することができます。さらに、クリニックで大腸癌は敏感体薬19。
この記事ではレトロ ウイルス感染による HT29 DR3 安定したセルラインを生成を可能にする手法について述べる.さらに西部にしみが付くことを使用してこれらのセルの DR3 式を検証する方法、およびセル実行可能性の試金と形態学的観察を用いた体剤への感受性を評価する方法を示します。セルは単一のクローンから増幅され、したがって、均質な遺伝的背景の利点があります。また、DR3 にフラグ タグを生化学的アプローチによる顕微鏡と遺伝子発現および蛋白質の相互作用の解析から細胞 DR3 の可視化のため使用。さらに、セルは異種マウス体内antimitotics14の応答で腫瘍の進行をさらに分析できます。
DR3 HT29 細胞システムは、どのように antimitotics を殺す癌細胞14の分子機構を研究するための効果的なツールを提供しました。過剰発現とノックダウン細胞は遺伝子の機能を研究するための一般的なツールであるのでこのプロトコル興味やその他の細胞の他の遺伝子にも容易に適合でき、したがって、広く使用されたアプローチと化した。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C11965500BT</td>
			<td>Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMXs-IRES-Blasicidin</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RTV-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14190500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse secondary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT29 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plat-A cell line</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning Cylinder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT3MV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX53 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plates</td>
			<td>Nest</td>
			<td>712001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture plates</td>
			<td>Nest</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m steril filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well White Polystyrene Microplate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western ECL Substrate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>ImageQuant LAS 4000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decoloring Shaker&#160;</td>
			<td>HINOTECH</td>
			<td>TS-2000A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-bl-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>TC 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing cell lines overexpressing dr3 to assess the apoptotic response to anti-mitotic therapeutics

興味の遺伝子の機能を勉強しては、ノックダウン細胞発現の減少や過剰発現細胞で発現を増加などの表現のレベルを操作することによって実現できます。過渡と安定したトランスフェクションは、外因性の遺伝子発現のため頻繁に使用される 2 つの方法です。トランスフェクションは、安定したトランスフェクションにより宿主細胞のゲノムに統合される外因性の遺伝子、継続的に表現されるに対しにのみ短期的な表現に便利です。その結果、安定したトランスフェクションは長期の遺伝的調節に研究のため通常用いられます。ここでタグ死受容体 3 DR3 関数を探索する (DR3) を過剰発現安定したセルラインを生成するための単純なプロトコルについて述べる。均質性と安定したセルラインの純度を維持するためにレトロ ウイルス感染後単一クローンを選んだ。このプロトコルを使用して生成された安定したセルラインはこうして HT29 細胞におけるアポトーシス応答を再構成すること、抗がん剤の薬剤に敏感な DR3 欠損 HT29 細胞をレンダリングします。また、DR3 にフラグの札良い DR3 抗体の可用性の損失を補償し、体のエージェントは、アポトーシスを誘導する分子機構の生化学的研究を促進します。

DR3 を安定して発現する HT29 細胞の特性は図 1に示します。陰性対照となる野生型細胞が外因性の遺伝子発現を示さない間、クローンは DR3 のさまざまなレベルを表現します。ここでは 5 つの複製を示す中でクローン 1 と 5 は DR3 の最高レベルを表現します。1、5 次の実験のためのクローンを選びました。
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Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

抗有糸分裂治療に対するアポトーシス応答を評価するために DR3 を過剰発現細胞株の確立

遺伝子機能の研究に興味の遺伝子を過剰発現安定細胞株を確立することは、株それらを介してレトロ ウイルス感染後安定したトランスフェクション ピッキング単一クローンによって行うことができます。この方法で生成される DR3 HT29 細胞が死受容体 3 (DR3) antimitotics によるアポトーシス誘導に貢献機構を解明を紹介します。

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

細胞内の遺伝子を過剰発現させることは、遺伝子機能を研究する重要な方法です。レトロウイルスによる安定したトランスフェクションにより、内因性遺伝子を宿主ゲノムに統合し、連続的に発現させることができます。我々は、レトロウイルス感染の単一のコロニーを拾い上げ、FLAGタグ付きDR3を過剰に発現する安定した細胞株を生成した。細胞株は、良好なDR3抗体の利用不能を補償し、インビトロおよびインビボでDR3機能研究ポストのための優れたツールを提供した。我々は、レトロウイルス感染の単一コロニーを拾うことによってDR3過剰発現細胞株を生成した。単一コロニーからの細胞株は均質性および純度を維持することができた。さらに、プロトコルは扱いやすく、扱いやすく、簡単です。この手順を開始するには、DMEMの4ミリリットルで60ミリメートルの皿で一晩plat-A細胞を成長させます。細胞が80〜90%の合流に達したら、トランスフェクション試薬を使用して、製造マニュアルに記載されている2マイクログラムの構築されたプラスミドでそれらをトランスフェクトします。72時間後、上清を集める。0.45マイクロメートルの無菌フィルターを使用して、培地をフィルタリングし、ウイルス懸濁液を摂氏4度で暗闇の中に保ちます。次に、HT29細胞をDMEMで60ミリメートル皿で一晩成長させ、5%の二酸化炭素で摂氏37度で細胞をインキュベートする。細胞が30〜50%合流に達すると、ウイルス懸濁液のミリリットル当たり8マイクログラムのポリブレンの存在下で2ミリリットルのウイルス懸濁液に感染する。感染した細胞を摂氏37度で4~6時間インキュベートする。次いで、ウイルス懸濁液を吸引する。新鮮なDMEMを4ミリリットル加え、皿をインキュベーターに戻します。感染後24時間で、食器から培地を取り除き、慎重に予温PBSの2ミリリットルで細胞を洗います。トリプシンEDTAを1ミリリットル加え、37°Cで3分間培養します。顕微鏡を10倍の倍率で観察し、細胞の大部分が剥離していることを確認します。この後、10%FBSを含むDMEMを2ミリリットル加えてトリプシン化を停止し、15ミリリットルのチューブに細胞懸濁液を回収します。室温で5分間200回gで遠心分離機を、上清を取り除きます。セルペレットを10ミリリットルのDMEMで再中断し、ピペットを上下に軽くして混ぜます。次に、30、100、および300の係数で細胞を希釈する。細胞の種子は、それぞれ1ミリリットル当たり1マイクログラムの濃度でブラストシジンを含むDMEMの20ミリリットルを含む150ミリメートルの皿です。摂氏37度で5%の二酸化炭素を約1~2週間インキュベートします。この期間中、10倍の倍率で反転した顕微鏡を使用して、毎日コロニーを観察します。コロニーの直径がおよそ1〜2ミリメートルである場合、皿の底によく隔離されたコロニーをマークします。インキュベーション期間が終了したら、培地を吸引し、3ミリリットルの予熱PBSで細胞を洗浄する。60ミリメートル皿にトリプシンEDTAを2ミリリットル加えます。無菌鉗子を使用して、オートクレーブされた滅菌クローニングシリンダーをピックアップし、皿に入れます。次に、各シリンダに約30マイクロリットルのトリプシンEDTAが含まれるシリンダーをピックアップし、マークされたコロニーの上にそっと置きます。皿をインキュベーターに3分間戻します。この後、顕微鏡下の細胞を調べて、細胞が切り離されていることを確認します。細胞が持ち上がったとき、各シリンダーに培養培地の70マイクロリットルでトリプシンを不活性化する。200マイクロリットルのピペットを使用してセルサスペンションを穏やかに混合し、混合しながらシリンダーを動かさないようにします。2つの24ウェルプレートをセットし、プレートAとプレートBにラベルを付け、各ウェルにDMEMの1ミリリットルを追加します。30マイクロリットルのセル懸濁液をプレートAの各ウェルに加え、対応するプレートBのウェルに70マイクロリットルを加え、プレートをインキュベーターに戻します。プレートBの細胞が90%合流したら、培地を取り出し、PBSの1ミリリットルで慎重に細胞を洗います。PBSを完全に取り除き、細胞を溶す1X SDS-PAGEローディングバッファの50マイクロリットルを加えた。5分後、24ウェルプレートから1.5ミリリットルの遠心分離チューブに細胞ライセートを移します。100°Cで10分間沸騰させます。10%SDSゲルで、80ボルトの定電圧で15分間、1時間120ボルトでサンプルを実行します。次に、400ミリアンペアの一定電流で2時間の一定電流での湿移により、フッ化ビニリデン膜にタンパク質を移す。TBSTに溶解した5%ノンファットミルクで5,000の倍で一次抗体を希釈します。FLAG抗体を膜に加え、一晩摂氏4度でインキュベートする。200 RPMに設定した脱色シェーカーを使用して、膜をTBSTで15分間洗浄し、5分ごとにTBSTをリフレッシュします。次いで、抗マウス二次抗体を5%ノンファットミルク中に10,000倍に希釈する。膜を4°Cで5~6時間インキュベートします。先に述べたように脱色シェーカー上の膜を再度洗浄する。この後、西洋の強化された化学発光とゲルドキュメンテーションシステムを使用して、膜を画像化し、FLAG発現を検出します。まず、トリプシン法によりHT29細胞とHT29-DR3細胞の両方を採取し、セル密度を測定するために自動セルカウンタを使用します。12ウェルプレートのウェルに播種し、DMEMで1ウェルあたり30,000細胞の密度で、5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、1%DMSOを陰性対照として使用する細胞を含む各ウェルにジアゾナミドのナノモル10ナノモルを加え、5%の二酸化炭素で摂氏37度のインキュベーターにプレートを移す。48時間の治療後、顕微鏡で細胞を10倍の倍率で画像化します。次に、HT29とHT29-DR3の両方の細胞を、1ウェルあたり3,000細胞の密度でDMEMを備えた96ウェルプレートのウェルに播種し、一晩で摂氏37度で成長させます。翌日、テキストプロトコルで概説されているように、用量エスカレートジアゾンアミド濃度を追加します。48時間の治療の後、発光ベースの細胞生存アッセイキットを使用して、細胞の生存率を測定する。インキュベーターから96ウェルプレートを取り出し、室温で約30分間放置します。次に、各ウェルに50マイクロリットルのアッセイ試薬を加え、プレートを室温で2分間振って細胞をライゼします。プレートを室温で10分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーを使用して各ウェルの発光を決定します。DR3を安定的に発現するHT29細胞の特性評価は、クローンがDR3の様々なレベルを発現し、野生型細胞が外因性遺伝子発現を示さないことを明らかにする。遺伝子1と5は、DR3の最高レベルを発現するように見られ、さらなる実験のために選択されます。HT29およびHT29-DR3細胞の形態は、ジアゾンアミドで48時間治療された後に観察される。HT29-DR3細胞は、細胞膜の破損および細胞の破片を伴う明らかなアポトーシスを示す。しかし、HT29細胞は、丸め細胞形状を示す無傷の細胞を有する有糸分裂逮捕のみを示す。これらの細胞タイプの細胞生存率は、ジアゾンアミドの3ナノモルで48時間治療された後に決定される。HT29-DR3細胞は80%以上の細胞死を有すると見られるが、親HT29細胞は有糸分裂性逮捕の形でわずかな応答のみを示す。これは、DR3の過剰発現がこれらの細胞におけるジアゾンアミド誘導アポトーシス経路を再構成したことを示している。適切なシリアル希釈は、単一クローンの最適な密度を得るために重要です。また、すべてのクローンシリンダにコロニーが1つだけ含まれていることを確認し、近くのコロニーを汚染しないようにすることも重要です。DR3は細胞株を過剰発現させることで、インビトロでの分子機構の生化学的研究を促進した。HT29-DR3細胞の皮下注射により異種移植片HT29-DR3を生成し、抗ミトーシス剤によるインビボでのアポトーシスのメカニズムを詳しく説明しました。このプロトコルは、他の細胞株で関心のある遺伝子を研究するために使用することができます。さらに、遺伝子ノックアウトは機能研究のもう一つの方法であり、私たちのプロトコルは遺伝子ノックダウンシステムに適応することができます。したがって、遺伝子機能の解明に一般的に適用可能である。安全処分のために、ゴミにウイルスリレーをゴミに落とすことを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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