Name: establishing cell lines overexpressing dr3 to assess the apoptotic response to anti-mitotic therapeutics
Uploaded: 2019-01-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd 53110000117 (til GW) og 043222019 (til X.W.) fra Tsinghuauniversitetet.

Vær oppmerksom på at alle mus eksperimenter beskrevet her var godkjent og utført i henhold til institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Tsinghua University.
1. generasjon DR3 overuttrykte linjer
<ol><li>Konstruere plasmider DR3 uttrykk (pMXs-IRES-DR3-flagg) ved å sette full lengde DR3 cDNA med 3 x flagg på C-terminus i retroviral vektor pMXs-IRES-Blasticidin ved begrensning BamHI/XhoI.</li>
	<li>Vokse Plat-A celler i 60 mm retter med 4 mL av Dulbeccos endret Eagle's med...

<ol>
	<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Recillas-Targa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+for+gene+transfer,+expression,+knockdown,+and+chromatin+influence+in+mammalian+cell+lines+and+transgenic+animals.">Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals.</a> Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).</li><li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+BCR/ABL-induced+leukemias.">Animal models of BCR/ABL-induced leukemias.</a> Leukemia &amp; Lymphoma. 11, 57-60 (1993).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+correction+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+ex+vivo+gene+therapy.+The+New+England.">Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England.</a> Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).</li><li>Roesler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-generation,+self-inactivating+gp91(phox)+lentivector+corrects+the+oxidase+defect+in+NOD/SCID+mouse-repopulating+peripheral+blood-mobilized+CD34++cells+from+patients+with+X-linked+chronic+granulomatous+disease.">Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease.</a> Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).</li><li>Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+heart+gene+delivery+vectors.">The evolution of heart gene delivery vectors.</a> The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).</li><li>Zhou, J., Giannakakou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+microtubules+for+cancer+chemotherapy.">Targeting microtubules for cancer chemotherapy.</a> Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).</li><li>Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeted+agents:+when+mitochondria+become+essential+to+chemotherapy.">Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).</li><li>Bhalla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeted+anticancer+agents+and+apoptosis.">Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis.</a> Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).</li><li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs.">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li><li>Bhat, K. M., Setaluri, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-associated+proteins+as+targets+in+cancer+chemotherapy.">Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).</li><li>Bates, D., Eastman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+destabilising+agents:+far+more+than+just+antimitotic+anticancer+drugs.">Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).</li><li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-mitotic+chemotherapeutics+promote+apoptosis+through+TL1A-activated+death+receptor+3+in+cancer+cells.">Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells.</a> Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).</li><li>Marsters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apo-3,+a+new+member+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family,+contains+a+death+domain+and+activates+apoptosis+and+NF-kappa+B.">Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B.</a> Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).</li><li>Chinnaiyan, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+by+DR3,+a+death+domain-containing+receptor+related+to+TNFR-1+and+CD95.">Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95.</a> Science. 274 (5289), 990-992 (1996).</li><li>Xu, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+receptor+3+mediates+TNFSF15-+and+TNFalpha-induced+endothelial+cell+apoptosis.">Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 55, 109-118 (2014).</li><li>Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TL1A-induced+NF-kappaB+activation+and+c-IAP2+production+prevent+DR3-mediated+apoptosis+in+TF-1+cells.">TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).</li><li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+of+TWEAK-induced+cell+death.">Multiple pathways of TWEAK-induced cell death.</a> Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning:+powerful+tools+in+functional+genomics.">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li><li>Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazonamide+toxins+reveal+an+unexpected+function+for+ornithine+delta-amino+transferase+in+mitotic+cell+division.">Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).</li><li>Hassan, M. S., von Holzen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Model:+Xenograft+Mouse+Models+in+Esophageal+Adenocarcinoma.">Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma.</a> Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).</li><li>Potter, H., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+by+electroporation.">Transfection by electroporation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effects+of+transfection:+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells.">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).</li><li>Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+responses+in+the+HeLa+proteome+subsequent+to+transient+plasmid-mediated+transfection.">Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).</li><li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+the+toxicogenomics+and+the+genotoxic+potential+of+a+cationic+lipid-based+gene+delivery+nanosystem+in+human+alveolar+epithelial+a549+cells.">Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).</li></ol>

I dette manuskriptet beskriver vi en metode for å generere HT29-DR3 stabile linjer. HT29-DR3 celler gir en modell for å studere molekylære mekanismer som DR3 bidrar til apoptose indusert av antimitotic agenter. Denne tilnærmingen er allsidig og repeterbare. For å sikre suksess for prosedyren, må fire sentrale trinn av protokollen vurderes. Først, for å produsere en høy nok virus titer, det anbefales å utføre DNA transfection når Plat-A cellene på 80-90% samløpet. Andre bør viral suspensjon lagres på 4 ° ...

Heterologous genuttrykk er ofte ansatt å studere funksjonen av gener av interesse. To metoder, forbigående og stabil transfection, prevalently brukes i celler og molekylærbiologi å sette inn et segment av DNA eller RNA i verten celle1,2. Transiently transfekterte DNA eller RNA kan ikke videreformidles til datter celler, så genetisk endring bare beholdes i en kort tidsperiode. På den annen side, i stabilt transfekterte celler, er eksogene gener integrert i vert celle genomet, opprettholde sitt uttrykk i cellen linje. Dermed er stabil transfection en metode som er vanligvis reservert for forskning på langsiktige genetisk regulering. Stabil celle linjen kan også være transplantert som xenografts til musen modeller in vivo studere3. Stabil transfection kan deles inn i to kategorier: virus- og nonviral. Sammenlignet med nonviral hva, kan virusinfeksjon overføre gener til et bredere utvalg av menneskelige celler med en høyere effektivitet4,5,6,7. Videre tilbyr en stabil cellen linje fra en enkel klone fordelen av homogenitet og klonal renhet.
Ukontrollert cellevekst og deling er de mest særtrekk av kreft. I kliniske innstillinger er antimitotic agenter de primære behandlingene for mange typer av svulster8. Men ikke kan noen betydelige begrensninger av antimitotic agenter ignoreres. Først disse chemotherapies også kan drepe normale celler med uønsket cancerous celler, og dermed kan føre til alvorlige bivirkninger8. Andre, antitubulin narkotika er ikke effektiv mot alle typer av svulster, til tross for tubulin's allestedsnærværende uttrykk i en rekke forskjellige vev som en cellen cytoskjelett proteiner9,10. Det er uklart hvorfor antitubulin agenter viste lovende effekt mot eggstokkene, lunge og Hematologisk kreft i klinisk behandling, men ikke i nyre, kolon eller pancreatic kreft11. Til slutt, selv pasienter med samme type svulst kan svare på antimitotics annerledes på en uforutsigbar måte. Det kan være en nøkkel effektor molekyl som påvirker følsomheten pasienter antimitotic agenter, som resulterer i ulike resultatene sett i klinisk behandling12. Dermed bør potensielle differensial problemområdene av pasienter til antimitotic behandling tas i betraktning for å optimalisere terapeutisk intervensjon13.
En høy gjennomstrømming hele-genome siRNA biblioteket skjermen vist at DR3 knockdown kan gjengi følsom celler motstandsdyktig mot antimitotic narkotika, implicating en rolle for DR3 i kjemoterapi-indusert apoptose14. Som medlem av tumor nekrose faktor reseptor (TNFR) gruppe, har DR3 blitt rapportert å megle celle apoptose i ulike systemer15,16,17,18. Derfor begynte vi for å etablere stabil linjer overexpressing DR3 for å studere molekylære mekanismer som antimitotic narkotika indusere apoptose. En riktig celle modell for å studere DR3 overuttrykte kan gis av menneskelig kolon kreft celle HT29, som ble funnet for å være DR3-mangelfull. I tillegg i klinikken, kolon kreft er ufølsom for antimitotic narkotika19.
I denne artikkelen beskriver vi en metode som tillater generering av en HT29-DR3 stabile cellen linje gjennom retroviral infeksjon. Videre viser vi hvordan å validere DR3 uttrykket i disse cellene med vestlige blotting og vurdere følsomheten til antimitotic agenter ved å bruke celle levedyktighet analysen og morfologiske observasjon. Cellene er forsterket fra enkelt kloner, og dermed har fordelen av en homogen genetisk bakgrunn. I tillegg tillatt flagg koden på DR3 for visualisering av mobilnettet DR3 mikroskopi og analyse av gene expression og protein samspillet av biokjemiske tilnærminger. Videre kan cellene xenografted i mus å analysere svulst progresjon svar på antimitotics i vivo14.
HT29-DR3 cellen systemet presenteres her tilbys et effektivt verktøy for å studere molekylære mekanismer av hvordan antimitotics drepe kreft celler14. Siden overuttrykte og pusse cellelinjer er vanlige verktøy for å studere gen funksjon, denne protokollen kan tilpasses enkelt andre gener severdigheter eller andre linjer, og dermed forvandlet til en mye brukt tilnærming.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C11965500BT</td>
			<td>Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMXs-IRES-Blasicidin</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RTV-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14190500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse secondary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT29 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plat-A cell line</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning Cylinder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT3MV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX53 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plates</td>
			<td>Nest</td>
			<td>712001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture plates</td>
			<td>Nest</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m steril filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well White Polystyrene Microplate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western ECL Substrate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>ImageQuant LAS 4000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decoloring Shaker&#160;</td>
			<td>HINOTECH</td>
			<td>TS-2000A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-bl-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>TC 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing cell lines overexpressing dr3 to assess the apoptotic response to anti-mitotic therapeutics

Studere funksjonen til en genet av interesse kan oppnås ved å manipulere nivået av uttrykk, for eksempel redusere sitt uttrykk med knockdown linjer eller øke sitt uttrykk med overuttrykte linjer. Forbigående og stabil transfection er to metoder som ofte brukes for eksogene genuttrykk. Forbigående hva er bare nyttig for kortsiktige uttrykk, mens stabil transfection gir eksogene gener å bli integrert i vert celle genomet der det vil være kontinuerlig uttrykt. Som et resultat, er stabil transfection vanligvis ansatt for forskning i langsiktig genetisk regulering. Her beskriver vi en enkel protokoll for å generere en stabil cellen linje overexpressing merket død reseptor 3 (DR3) for utforske DR3 funksjon. Vi plukket enkelt kloner etter en retroviral infeksjon for å opprettholde homogenitet og renhet av de stabile linjene. De stabile cellelinjer generert ved hjelp av denne protokollen gjengi DR3 dårlig HT29 celler følsom for antimitotic stoffene, dermed gjenoppbygge apoptotisk svaret i HT29 celler. Videre flagg koden på DR3 kompenserer for utilgjengelighet av god DR3 antistoffer og muliggjør biokjemiske studiet av molekylære mekanismen som antimitotic agenter forårsake apoptose.

Karakteristikk av HT29 celler uttrykke stabilt DR3 er vist i figur 1. Kloner uttrykke varierende grad av DR3, mens de vill-type cellene, som fungerer som en negativ kontroll, ikke viser eksogene genuttrykk. Her viser vi bare fem kloner, hvorav klone 1 og 5 uttrykke høyeste DR3. Vi valgte klone 1 og 5 for følgende eksperimenter.
Morfologi av HT29 og HT29-DR3-cellene etter administrasjon av diazonam...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics at JoVE.com

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Etablere linjer Overexpressing DR3 å vurdere apoptotisk svaret anti-mitotisk Therapeutics

Stabil celle linjen overexpressing en genet av interesse å studere gen funksjon kan gjøres av stabil transfection-plukking enkelt kloner etter transfecting dem via retroviral infeksjon. Her viser vi at HT29-DR3 cellelinjer generert på denne måten belyse mekanismer som død reseptor 3 (DR3) bidrar til antimitotics-indusert apoptose.

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

Overuttrykkende gener i celler er en viktig måte å studere genfunksjon på. Stabil transfection med retroviruset gjør at endogene gener kan integreres i vertsgenomet og uttrykkes kontinuerlig. Vi plukket opp enkeltkolonier av retroviral infeksjon og genererte stabile cellelinjer overuttrykkende FLAG-merket DR3.Cellelinjene kompenserte for utilgjengeligheten av godt DR3-antistoff og ga gode verktøy for DR3-funksjonsstudie post in vitro og in vivo. Vi genererte DR3 overexpression cellelinjer ved å plukke opp en enkelt koloni av retroviral infeksjon. Cellelinjer fra enkeltkoloni kunne opprettholde homogeniteten og renheten.I tillegg er protokollen enkel og enkel å håndtere. For å begynne denne prosedyren, vokse plat-A celler over natten i 60-millimeter retter med fire milliliter DMEM. Når cellene når 80 til 90% samløpet, bruk transfection reagens for å transfisere dem med to mikrogram av den konstruerte plasmid som beskrevet i produsentens håndbok.Etter 72 timer, samle supernatant. Bruk et sterilt filter på 0,45 mikrometer, filtrer mediet og hold virusfjæringen i mørket ved fire grader Celsius. Deretter vokser HT29 celler over natten i en 60-millimeter tallerken med DMEM, inkubere cellene ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid.Når cellene når 30 til 50% samløpet, infisere dem med to milliliter viral suspensjon i nærvær av åtte mikrogram polybrene per milliliter viral suspensjon. Inkuber de infiserte cellene ved 37 grader Celsius i fire til seks timer. Deretter aspirerer viral suspensjon.Tilsett fire milliliter frisk DMEM og returner parabolen til inkubatoren. Ved 24 timer etter infeksjon, fjern media fra oppvasken og vask forsiktig cellene med to milliliter forhåndsoppvarmet PBS. Tilsett en milliliter trypsin EDTA, og inkuber cellene ved 37 grader Celsius i tre minutter.Ved hjelp av et mikroskop ved 10 ganger forstørrelse, observere cellene for å sikre at de fleste av dem har løsrevet. Etter dette legger du til to milliliter DMEM som inneholder 10% FBS for å stoppe trypsiniseringen, og samle cellesuspensjonen i et 15-milliliter rør. Sentrifuge ved 200 ganger g i fem minutter ved romtemperatur, og fjern supernatanten.Re-suspendere cellepellet i 10 milliliter DMEM og forsiktig pipette opp og ned for å blande. Deretter fortynner cellene etter faktorer på 30, 100 og 300. Seed cellene er 150-millimeter retter som hver inneholder 20 milliliter DMEM som inneholder blasticidin i en konsentrasjon på ett mikrogram per milliliter.Inkuber ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i omtrent en til to uker. I løpet av denne perioden, bruk et invertert mikroskop ved 10 ganger forstørrelse for å observere koloniene hver dag. Merk de godt isolerte koloniene på bunnen av parabolen når kolonienes diameter er omtrent en til to millimeter.Når inkubasjonsperioden er fullført, aspirerer mediet og vask cellene med tre milliliter forhåndsoppvarmet PBS. Tilsett to milliliter trypsin EDTA i en 60-millimeters tallerken. Bruk sterile tang for å plukke opp autoklavertsterile kloning sylindere og plassere dem i parabolen.Deretter plukker du opp sylinderne som nå hver inneholder ca. 30 mikroliter trypsin EDTA, og plasserer dem forsiktig over de merkede koloniene. Returner parabolen til inkubatoren i tre minutter. Etter dette kontrollerer du cellene under et mikroskop for å sikre at de har løsnet.Når cellene har løftet opp, på 70 mikroliter kultur medium til hver sylinder for å inaktivere trypsin. Bruk en 200 mikroliter pipette til å blande cellefjæringen forsiktig, og pass på at du ikke beveger sylinderen mens du blander. Sett ut to 24-brønns plater, og merk dem plate A og plate B.Legg til en milliliter DMEM til hver brønn.Tilsett 30 mikroliter cellefjæring i hver brønn av plate A, og tilsett 70 mikroliter til de tilsvarende brønnene av plate B.Plasser platene tilbake i inkubatoren. Når cellene i plate B er på 90% samløpet, fjern mediet og vask forsiktig cellene med en milliliter PBS. Fjernet PBS helt, og legg til 50 mikroliter 1X SDS-PAGE lasting buffer for å lyse cellene.Etter fem minutter overfører du cellelylaten fra 24-brønnsplaten til 1,5 milliliter sentrifugerør. Kok prøvene ved 100 grader Celsius i 10 minutter. Kjør prøvene på 10% SDS gel med en konstant spenning på 80 volt i 15 minutter og deretter på 120 volt i en time.Deretter overfører proteinet til en polyvinylidfluoridmembran ved våt overføring med en konstant strøm på 400 milliamper i to timer. Fortynn det primære antistoffet med en faktor på 5 000 i 5 % fettfri melk som oppløses i TBST. Tilsett FLAG-antistoffet til membranen, og inkuber ved fire grader Celsius over natten.Bruk en decoloring shaker satt til 200 RPM, vask membranen med TBST i 15 minutter, forfriskende TBST hvert femte minutt. Deretter fortynner du et anti-mus sekundært antistoff med en faktor på 10 000 i 5% fettfri melk. Inkuber membranen med fortynnet sekundært antistoff ved fire grader Celsius i fem til seks timer.Vask membranen på decoloring shaker igjen som tidligere beskrevet. Etter dette, bruk vestlig forbedret chemiluminescence og et geldokumentasjonssystem for å bilde membranen og oppdage FLAG-uttrykket. Først samler du inn både HT29- og HT29-DR3-celler ved trypsinisering, og bruker en automatisk celleteller til å måle celletettheten.Seed cellene inn i brønnene av 12-brønnplater med DMEM med en tetthet på 30 000 celler per brønn, og inkuber over natten ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Neste dag, tilsett 10 nanomolar diazonamid til hver brønn som inneholder celler som bruker 1% DMSO som en negativ kontroll, og overføre platene til en inkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Etter 48 timers behandling, bilde cellene under et mikroskop ved 10 ganger forstørrelse.Deretter frø både HT29 og HT29-DR3 celler i brønnene av 96-brønns plate med DMEM med en tetthet på 3000 celler per brønn, og la dem vokse ved 37 grader Celsius over natten. Neste dag, legge dose-eskalerende diazonamid konsentrasjoner som beskrevet i tekstprotokollen. Etter 48 timers behandling, bruk et luminescence-basert celle levedyktighetsanalysesett for å måle celle levedyktigheten.Fjern 96-brønnplaten fra inkubatoren, og la den stå ved romtemperatur i ca. 30 minutter. Deretter legger du til 50 mikroliter med analysereagenser til hver brønn, og rister platen i to minutter ved romtemperatur for å lyse cellene. Inkuber platen ved romtemperatur i 10 minutter, og bruk deretter en mikroplateleser til å bestemme lysstyrken på hver brønn.Karakterisering av HT29-celler som uttrykker DR3, viser at klonene uttrykker varierende nivåer av DR3, mens de ville cellene ikke viser eksogene genuttrykk. Gener en og fem er sett for å uttrykke de høyeste nivåene av DR3, og så er valgt for videre eksperimenter. Morfologien til HT29- og HT29-DR3-celler observeres etter å ha blitt behandlet i 48 timer med diazonamid.HT29-DR3-celler viser åpenbar apoptose med en ødelagt cellemembran og celleavfall. HT29-celler viser imidlertid bare mitotisk arrest med intakte celler som viser en opprundet celleform. Celle levedyktigheten til disse celletypene bestemmes deretter etter å ha blitt behandlet i 48 timer med tre nanomolar diazonamid.HT29-DR3 celler er sett å ha en celledød på over 80%mens foreldreneS HT29-celler viser bare en liten respons i form av mititotisk arrest. Dette indikerer at overuttrykket av DR3 rekonstituerte diazonamid-indusert apoptotisk vei i disse cellene. Riktig seriefortynninger er viktig for å få optimal tetthet av enkle kloner.Det er også viktig å sørge for at hver klone sylinder bare inneholder en koloni og for å unngå forurensende nærliggende kolonier. DR3-overuttrykkende cellelinjer gjorde det mulig å studere biokjemiske mekanismer in vitro. Vi genererte HT29-DR3 xenografts gjennom subkutan injeksjon av HT29-DR3 celler, og det bidro til å utdype mekanismene for antimitotiske midler-indusert apoptose in vivo.Denne protokollen kan brukes til å studere gener av interesse i andre cellelinjer. I tillegg er gennedslag på en annen måte for funksjonell studie, og vår protokoll kan tilpasses genbankesystemer. Dermed er det generelt aktuelt å belyse genfunksjoner.Husk å slippe virusreléet til søppelet til bestemte beholdere for sikkerhetsdeponering.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Intracarotid Cancer Cell Injection å produsere mus modeller av hjernemetastaser

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Generasjon av prostata kreft cellen modeller av motstand mot anti-mitotisk Agent Docetaxel

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Betinget Knockdown av genuttrykk i kreftcelle linjer å studere rekruttering av monocytter/makrofager til Tumor Microenvironment

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Langsiktig Live-celle Imaging for å vurdere celle skjebne som svar på paklitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Langsgående Intravital Imaging av Brain tumor Cell atferd som svar på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radiosensitivity av kreft stamceller i lungekreft cellelinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse av sidepopulasjon i faste tumorcellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Transmitokondriell Cybrid-generering fra suspensjonsvoksende kreftceller

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Forfatter Spotlight: Transmitokondriell cybridgenerering ved bruk av kreftcellelinjer  

Transmitochondrial cybrid generasjon ved hjelp av kreftcellelinjer

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...