Name: establishing cell lines overexpressing dr3 to assess the apoptotic response to anti-mitotic therapeutics
Uploaded: 2019-01-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios 53110000117 (a G.W.) e 043222019 (para X.W.) da Universidade de Tsinghua.

Por favor, note que todos os experimentos de rato aqui descritos foram aprovados e efectuados de acordo com o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) na Universidade de Tsinghua.
1. geração de linhas de células de superexpressão DR3
<ol><li>Construir o plasmídeo de expressão DR3 (pMXs-IRES-DR3-bandeira), inserindo cDNA de DR3 completo com 3 x bandeira no C-terminal em vetor retroviral pMXs-IRES-Blasticidin dos locais de restrição de BamHI/XhoI.</li>
	<li>Desenvolvem-se ...

<ol>
	<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Recillas-Targa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+for+gene+transfer,+expression,+knockdown,+and+chromatin+influence+in+mammalian+cell+lines+and+transgenic+animals.">Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals.</a> Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).</li><li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+BCR/ABL-induced+leukemias.">Animal models of BCR/ABL-induced leukemias.</a> Leukemia &amp; Lymphoma. 11, 57-60 (1993).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+correction+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+ex+vivo+gene+therapy.+The+New+England.">Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England.</a> Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).</li><li>Roesler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-generation,+self-inactivating+gp91(phox)+lentivector+corrects+the+oxidase+defect+in+NOD/SCID+mouse-repopulating+peripheral+blood-mobilized+CD34++cells+from+patients+with+X-linked+chronic+granulomatous+disease.">Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease.</a> Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).</li><li>Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+heart+gene+delivery+vectors.">The evolution of heart gene delivery vectors.</a> The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).</li><li>Zhou, J., Giannakakou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+microtubules+for+cancer+chemotherapy.">Targeting microtubules for cancer chemotherapy.</a> Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).</li><li>Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeted+agents:+when+mitochondria+become+essential+to+chemotherapy.">Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).</li><li>Bhalla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeted+anticancer+agents+and+apoptosis.">Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis.</a> Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).</li><li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs.">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li><li>Bhat, K. M., Setaluri, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-associated+proteins+as+targets+in+cancer+chemotherapy.">Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).</li><li>Bates, D., Eastman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+destabilising+agents:+far+more+than+just+antimitotic+anticancer+drugs.">Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).</li><li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-mitotic+chemotherapeutics+promote+apoptosis+through+TL1A-activated+death+receptor+3+in+cancer+cells.">Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells.</a> Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).</li><li>Marsters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apo-3,+a+new+member+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family,+contains+a+death+domain+and+activates+apoptosis+and+NF-kappa+B.">Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B.</a> Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).</li><li>Chinnaiyan, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+by+DR3,+a+death+domain-containing+receptor+related+to+TNFR-1+and+CD95.">Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95.</a> Science. 274 (5289), 990-992 (1996).</li><li>Xu, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+receptor+3+mediates+TNFSF15-+and+TNFalpha-induced+endothelial+cell+apoptosis.">Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 55, 109-118 (2014).</li><li>Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TL1A-induced+NF-kappaB+activation+and+c-IAP2+production+prevent+DR3-mediated+apoptosis+in+TF-1+cells.">TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).</li><li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+of+TWEAK-induced+cell+death.">Multiple pathways of TWEAK-induced cell death.</a> Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning:+powerful+tools+in+functional+genomics.">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li><li>Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazonamide+toxins+reveal+an+unexpected+function+for+ornithine+delta-amino+transferase+in+mitotic+cell+division.">Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).</li><li>Hassan, M. S., von Holzen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Model:+Xenograft+Mouse+Models+in+Esophageal+Adenocarcinoma.">Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma.</a> Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).</li><li>Potter, H., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+by+electroporation.">Transfection by electroporation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effects+of+transfection:+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells.">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).</li><li>Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+responses+in+the+HeLa+proteome+subsequent+to+transient+plasmid-mediated+transfection.">Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).</li><li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+the+toxicogenomics+and+the+genotoxic+potential+of+a+cationic+lipid-based+gene+delivery+nanosystem+in+human+alveolar+epithelial+a549+cells.">Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).</li></ol>

Este manuscrito, descrevemos um método para gerar linhas de célula estável HT29-DR3. HT29-DR3 células fornecem um modelo para estudar os mecanismos moleculares pelos quais DR3 contribui para a apoptose induzida por agentes antimitóticos. Esta abordagem é versátil e repetíveis. Para garantir o sucesso do procedimento, quatro etapas-chave do protocolo precisam ser considerados. Em primeiro lugar, a fim de produzir uma alta suficiente concentração de vírus, recomenda-se realizar a transfeccao de DNA quando as cé...

Expressão gênica heteróloga é frequentemente usado para estudar a função dos genes de interesse. Dois métodos, transfecção transiente e estável, são predominantemente utilizados em células e biologia molecular para inserir um segmento de DNA ou RNA em uma célula de acolhimento1,2. Transitoriamente transfectadas DNA ou RNA não pode ser passado às células, para que a alteração genética só pode ser retida por um curto período de tempo. Por outro lado, nas células transfectadas estàvel, genes exógenos são integrados no genoma da célula de acolhimento, sustentando a sua expressão na linhagem celular. Assim, transfection estável é um método que é geralmente reservado para a investigação em regulamento genética a longo prazo. A linha celular estável também pode ser transplantada como xenografts em modelos do rato in vivo estudo3. Transfection estável pode ser dividido em duas categorias: nonviral e virais. Comparado a nonviral transfecção, infecção viral pode transferir genes para uma ampla variedade de células humanas com uma maior eficiência4,5,6,7. Além disso, uma linha de celular estável de um único clone oferece a vantagem de homogeneidade e pureza clonal.
Divisão e crescimento descontrolado de células são as características de câncer. Em ambientes clínicos, agentes antimitóticos são os tratamentos primários para muitos tipos de tumores8. No entanto, algumas limitações significativas de agentes antimitóticos não podem ser ignoradas. Em primeiro lugar, esses agentes quimioterápicos também podem matar células normais juntamente com as células cancerosas indesejáveis e, assim, podem resultar em efeitos colaterais graves8. Segunda, antitubulin de drogas não são eficazes contra todos os tipos de tumores, apesar da expressão de onipresente da tubulina em uma grande variedade de tecidos diferentes, como uma proteína do citoesqueleto9,10. Não está claro por que agentes antitubulin mostraram promissor eficácia contra ovário, pulmão e cancros hematológicos no tratamento clínico, mas não no rim, cólon ou cânceres pancreáticos11. Finalmente, mesmo os pacientes com o mesmo tipo de tumor podem responder para os antimitotics diferente de forma imprevisível. Pode haver uma molécula efetora chave que afeta a sensibilidade dos pacientes diferentes agentes antimitóticos, resultando em diversos resultados vistos no tratamento clínico12. Assim, as potenciais sensibilidades diferenciais dos pacientes ao tratamento antimitóticos devem ser tomadas em consideração para otimizar intervenções terapêuticas13.
Uma tela de biblioteca do elevado-throughput do inteiro-genoma siRNA demonstrou que o knockdown DR3 poderia render sensíveis células resistentes a drogas antimitóticas, implicando um papel para DR3 na apoptose induzida por quimioterapia14. Como um membro da superfamília do receptor (TNFR) de fator de necrose tumoral, DR3 tem sido relatado para mediar a apoptose celular em diversos sistemas15,16,17,18. Assim, partimos para estabelecer linhas de célula estável superexpressão DR3 para estudar os mecanismos moleculares pelos quais Medicamentos antimitóticos induzem apoptose. Um modelo de célula apropriada para o estudo DR3 superexpressão pode ser fornecido pela linha de celular de câncer de cólon humano HT29, que foi encontrado para ser DR3-deficiente. Além disso, na clínica, cancros do cólon são insensíveis a medicamentos antimitóticos19.
Neste artigo, descrevemos um método que permite a geração de uma linhagem de células estáveis de HT29-DR3 através de infecção retroviral. Ainda mais, nós mostramos como validar a expressão DR3 nestas células usando a mancha ocidental e como avaliar a sensibilidade aos agentes antimitóticos usando um ensaio da viabilidade celular e observação morfológica. As células são amplificadas de clones único e, assim, têm a vantagem de um fundo genético homogênea. Além disso, o tag da bandeira no DR3 permitido para a visualização de DR3 celular por microscopia e análise da interação de expressão e da proteína do gene por abordagens bioquímicas. Além disso, as células podem ser xenografted em ratos para analisar mais a progressão do tumor em resposta a antimitotics no vivo14.
O sistema de célula de HT29-DR3 apresentado aqui ofereceu uma ferramenta eficaz para estudar os mecanismos moleculares de como antimitotics matar células de câncer14. Desde superexpressão e linhas celulares "knockdown" são ferramentas comuns para estudar a função do gene, este protocolo pode ser facilmente adaptado para outros genes de interesse ou outras linhas de células e, assim, transformou-se uma abordagem amplamente utilizada.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C11965500BT</td>
			<td>Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMXs-IRES-Blasicidin</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RTV-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14190500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse secondary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT29 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plat-A cell line</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning Cylinder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT3MV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX53 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plates</td>
			<td>Nest</td>
			<td>712001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture plates</td>
			<td>Nest</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m steril filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well White Polystyrene Microplate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western ECL Substrate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>ImageQuant LAS 4000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decoloring Shaker&#160;</td>
			<td>HINOTECH</td>
			<td>TS-2000A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-bl-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>TC 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing cell lines overexpressing dr3 to assess the apoptotic response to anti-mitotic therapeutics

Estudar a função de um gene de interesse pode ser conseguido manipulando o seu nível de expressão, tais como diminuindo sua expressão com linhagens celulares "knockdown" ou aumentando a sua expressão com linhas de células de superexpressão. Transfecção transiente e estável são dois métodos que são usados frequentemente para a expressão dos genes exógenos. Transfecção transiente é útil somente para expressão de curto prazo, Considerando que transfection estável permite que genes exógenos ser integrado no genoma da célula de acolhimento onde ele será continuamente expressa. Como resultado, transfection estável é geralmente empregado para pesquisa em regulamento genético a longo prazo. Aqui descrevemos um protocolo simples para gerar uma linha de celular estável superexpressão do receptor de morte marcou 3 (DR3) para explorar a função DR3. Nós escolhemos o único clones após uma infecção retroviral a fim de manter a homogeneidade e a pureza das linhas celulares estável. As linhas de célula estável geradas usando este protocolo processam DR3-deficiente HT29 células sensíveis às drogas antimitóticas, assim, reconstituir a resposta de apoptose em células HT29. Além disso, o tag da bandeira no DR3 compensa a indisponibilidade de bom anticorpo DR3 e facilita o estudo bioquímico do mecanismo molecular pelo qual agentes antimitóticos induzem apoptose.

Uma caracterização das pilhas HT29 estàvel expressando DR3 é mostrada na Figura 1. Os clones expressam níveis variados de DR3, enquanto as células do tipo selvagem, que serve como um controle negativo, não mostram a expressão dos genes exógenos. Aqui mostramos apenas cinco clones, entre os quais clonar 1 e 5 expressam o alto nível de DR3. Nós escolhemos o clone 1 e 5 para os experimentos seguintes.
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Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Estabelecimento de linhas de celulares superexpressão DR3 para avaliar a resposta Apoptotic a terapêutica antimitótica

Estabelecer uma linha de celular estável superexpressão de um gene de interesse para estudar a função do gene pode ser feito por estável do transfection-colheita única clones, depois transfecting-los através de infecção retroviral. Aqui nós mostramos que linhas de célula HT29-DR3 geradas desta forma elucidar os mecanismos pelos qual morte receptor 3 (DR3) contribui para a apoptose induzida por antimitotics.

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

A superexpressão de genes nas células é uma maneira importante de estudar a função genética. Transfecção estável com o retrovírus permite que genes endógenos sejam integrados ao genoma hospedeiro e sejam expressos continuamente. Pegamos colônias únicas da infecção retroviral e geramos linhas de células estáveis superexpressando DR3 com marca de BANDEIRA.As linhas celulares compensaram a indisponibilidade de um bom anticorpo DR3 e forneceram excelentes ferramentas para o estudo da função DR3 pós in vitro e in vivo. Geramos as linhas de células de superexpressão DR3 captando uma única colônia da infecção retroviral. Linhas celulares de uma única colônia poderiam manter a homogeneidade e pureza.Além disso, o protocolo é fácil e simples de manusear. Para iniciar este procedimento, cresça células plat-A durante a noite em pratos de 60 milímetros com quatro mililitros de DMEM. Quando as células atingem 80 a 90% de confluência, use reagente de transfecção para transfetá-las com dois microgramas do plasmídeo construído, conforme descrito no manual do fabricante.Depois de 72 horas, pegue o supernaspe. Usando um filtro estéril de 0,45 micrômetro, filtre a mídia e mantenha a suspensão viral no escuro a quatro graus Celsius. Em seguida, cultivar células HT29 durante a noite em um prato de 60 milímetros com DMEM, incubando as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Quando as células atingem 30 a 50% de confluência, infecte-as com dois mililitros de suspensão viral na presença de oito microgramas de polibreno por mililitro de suspensão viral. Incubar as células infectadas a 37 graus Celsius por quatro a seis horas. Então, aspirar a suspensão viral.Adicione quatro mililitros de DMEM frescos e devolva o prato para a incubadora. Às 24 horas após a infecção, remova a mídia dos pratos e lave cuidadosamente as células com dois mililitros de PBS pré-aquecidos. Adicione um mililitro de trippsina EDTA, e incuba as células a 37 graus Celsius por três minutos.Usando um microscópio a 10 vezes a ampliação, observe as células para garantir que a maioria delas tenha se destacado. Depois disso, adicione dois mililitros de DMEM contendo 10% de FBS para parar a trippsinização e colete a suspensão celular em um tubo de 15 mililitros. Centrifugar a 200 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente, e remover o supernatante.Suspenda a pelota da célula em 10 mililitros de DMEM e aplique suavemente para cima e para baixo para misturar. Em seguida, diluir as células por fatores de 30, 100 e 300. Sementes as células são pratos de 150 milímetros que cada um contém 20 mililitros de DMEM contendo blasticidina a uma concentração de um micrograma por mililitro.Incubar a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por aproximadamente uma a duas semanas. Durante esse período, use um microscópio invertido a 10 vezes a ampliação para observar as colônias todos os dias. Marque as colônias bem isoladas na parte inferior do prato quando o diâmetro das colônias é de aproximadamente um a dois milímetros.Quando o período de incubação estiver completo, aspire o meio e lave as células com três mililitros de PBS pré-aquecidos. Adicione dois mililitros de trippsina EDTA em um prato de 60 milímetros. Use fórceps estéreis para pegar cilindros de clonagem estéril autoclavados e colocá-los no prato.Em seguida, pegue os cilindros que agora contêm aproximadamente 30 microliters de trypsin EDTA, e coloque-os suavemente sobre as colônias marcadas. Devolva o prato para a incubadora por três minutos. Depois disso, verifique as células sob um microscópio para garantir que elas se separaram.Quando as células se levantarem, a 70 microliters de cultura média a cada cilindro para inativar a trippsina. Use uma pipeta de 200 microliter para misturar suavemente a suspensão da célula, certificando-se de não mover o cilindro durante a mistura. Coloque duas placas de 24 poços, e rotule-as de placa A e placa B.Adicione um mililitro de DMEM a cada poço.Adicione 30 microliters de suspensão celular a cada poço da placa A, e adicione 70 microliters aos poços correspondentes da placa B.Coloque as placas de volta na incubadora. Quando as células da placa B estiverem com 90% de confluência, remova a mídia e lave cuidadosamente as células com um mililitro de PBS. Remova completamente o PBS e adicione 50 microliters de 1X buffer de carregamento SDS-PAGE para lise as células.Após cinco minutos, transfira o lisecelular da placa de 24 poços para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Ferva as amostras a 100 graus Celsius por 10 minutos. Execute as amostras em gel de 10% SDS a uma tensão constante de 80 volts por 15 minutos e depois a 120 volts por uma hora.Em seguida, transfira a proteína para uma membrana de flúor de polivinida por transferência molhada a uma corrente constante de 400 miliamperes por duas horas. Diluir o anticorpo primário por um fator de 5.000 em 5% de leite sem gordura que é dissolvido em TBST. Adicione o anticorpo FLAG à membrana e incubar a quatro graus Celsius durante a noite.Utilizando um agitador decoloramento definido para 200 RPM, lave a membrana com TBST por 15 minutos, atualizando o TBST a cada cinco minutos. Em seguida, diluir um anticorpo secundário anti-rato por um fator de 10.000 em leite sem gordura de 5%. Incubar a membrana com anticorpo secundário diluído a quatro graus Celsius por cinco a seis horas.Lave a membrana no agitador decoloramento novamente como descrito anteriormente. Depois disso, use a chemiluminescência aprimorada ocidental e um sistema de documentação de gel para imagem da membrana e detectar a expressão FLAG. Primeiro, colete as células HT29 e HT29-DR3 por tentativa de insinização, e use um contador automático de células para medir a densidade celular.Semear as células nos poços de placas de 12 poços com DMEM a uma densidade de 30.000 células por poço, e incubar durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, adicione 10 nanomolares de diazonamida a cada poço que contenha células usando 1%DMSO como controle negativo, e transfira as placas para uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após 48 horas de tratamento, imagem as células sob um microscópio a 10 vezes a ampliação.Em seguida, sementes ambas as células HT29 e HT29-DR3 nos poços de placa de 96 poços com DMEM a uma densidade de 3.000 células por poço, e permitem que elas cresçam a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione concentrações de diazonamida de aumento de dose, conforme descrito no protocolo de texto. Após 48 horas de tratamento, use um kit de ensaio de viabilidade celular baseado em luminescência para medir a viabilidade celular.Retire a placa de 96 poços da incubadora e deixe-a em temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos. Em seguida, adicione 50 microliters de reagentes de ensaio a cada poço, e agite a placa por dois minutos à temperatura ambiente para lise as células. Incubar a placa em temperatura ambiente por 10 minutos e, em seguida, usar um leitor de microplaca para determinar a luminescência de cada poço.A caracterização das células HT29 expressando o DR3 revela que os clones expressam níveis variados de DR3, enquanto as células do tipo selvagem não mostram expressão genética exógena. Os genes um e cinco são vistos para expressar os mais altos níveis de DR3, e por isso são escolhidos para outros experimentos. A morfologia das células HT29 e HT29-DR3 são observadas após serem tratadas por 48 horas com diazonamida.As células HT29-DR3 exibem apoptose óbvia com uma membrana celular quebrada e detritos celulares. No entanto, as células HT29 mostram apenas apreensão mitótica com células intactas que exibem uma forma de célula arredondada. A viabilidade celular desses tipos de células é então determinada após ser tratada por 48 horas com três nanomolares de diazonamida.As células HT29-DR3 são vistas com uma morte celular de mais de 80%, enquanto as células HT29 parentais demonstram apenas uma ligeira resposta na forma de prisão mitótica. Isso indica que a superexpressão do DR3 reconstituiu a via apoptóica induzida pela diazonamida nessas células. Diluições seriais adequadas são importantes para obter a densidade ideal de clones únicos.Também é importante garantir que cada cilindro clone contenha apenas uma colônia e evite contaminar colônias próximas. As linhas celulares superexpressas dr3 facilitaram o estudo bioquímico dos mecanismos moleculares in vitro. Geramos xenoenxertos HT29-DR3 através de injeção subcutânea de células HT29-DR3, e ajudou a elaborar os mecanismos de apoptose induzida por agentes antimitóticos in vivo.Este protocolo pode ser usado para estudar genes de interesse em outras linhas celulares. Além disso, o gene knockout é outra maneira de estudo funcional, e nosso protocolo pode ser adaptado aos sistemas de knockdown genético. Assim, é geralmente aplicável a funções genéticas elucidadas.Lembre-se de deixar cair o relé do vírus no lixo para recipientes específicos para descarte de segurança.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Intracarotídeo injeção de células de cancer para produzir mouse modelos de metástases cerebrais

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Pesquisa do câncer

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Geração de modelos de célula de câncer de próstata de resistência para o agente antimitótica Docetaxel

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Knockdown condicional de expressão gênica em linhas de células de câncer para estudar o recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do Tumor

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

A longo prazo viver-pilha de imagem para avaliar o destino da célula em resposta ao Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Imagem latente longitudinal de intravital do comportamento da pilha do tumor cerebral em resposta a uma biópsia cirúrgica invasora

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radiosensibilidade de células-tronco cancerosas em linhas celulares de câncer de pulmão

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Análise da população lateral em linhas celulares tumorais sólidas

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Geração de cíbridos transmitocondriais a partir de células cancerígenas em suspensão

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Autor em destaque: Geração de cíbridos transmitocondriais usando linhas de células cancerígenas  

Geração de Cybrid Transmitochondrial Usando Linhas de Células Cancerígenas

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...