Name: establishing cell lines overexpressing dr3 to assess the apoptotic response to anti-mitotic therapeutics
Uploaded: 2019-01-11T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por becas de 53110000117 (a GW) y 043222019 (a X.W.) de la Universidad de Tsinghua.

Tenga en cuenta que todos los experimentos de ratón aquí descritos fueron aprobados y realizados de acuerdo con el cuidado de Animal institucional y Comité uso (IACUC) en la Universidad Tsinghua.
1. generación de líneas de celulares sobreexpresión DR3
<ol><li>Construir el plásmido de expresión DR3 (pMXs-IRES-DR3-FLAG) mediante la inserción del cDNA integral DR3 con 3 x bandera en el c-terminal en vector retroviral pMXs-IRES-Blasticidin en los sitios de restricción de BamHI/XhoI.</l...

<ol>
	<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Recillas-Targa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+for+gene+transfer,+expression,+knockdown,+and+chromatin+influence+in+mammalian+cell+lines+and+transgenic+animals.">Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals.</a> Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).</li><li>Daley, G. 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The New England.</a> Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).</li><li>Roesler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-generation,+self-inactivating+gp91(phox)+lentivector+corrects+the+oxidase+defect+in+NOD/SCID+mouse-repopulating+peripheral+blood-mobilized+CD34++cells+from+patients+with+X-linked+chronic+granulomatous+disease.">Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease.</a> Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).</li><li>Russell, W. 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M., Setaluri, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-associated+proteins+as+targets+in+cancer+chemotherapy.">Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).</li><li>Bates, D., Eastman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+destabilising+agents:+far+more+than+just+antimitotic+anticancer+drugs.">Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).</li><li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-mitotic+chemotherapeutics+promote+apoptosis+through+TL1A-activated+death+receptor+3+in+cancer+cells.">Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells.</a> Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).</li><li>Marsters, S. 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W., Harran, P. G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazonamide+toxins+reveal+an+unexpected+function+for+ornithine+delta-amino+transferase+in+mitotic+cell+division.">Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).</li><li>Hassan, M. 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A., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+responses+in+the+HeLa+proteome+subsequent+to+transient+plasmid-mediated+transfection.">Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).</li><li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+the+toxicogenomics+and+the+genotoxic+potential+of+a+cationic+lipid-based+gene+delivery+nanosystem+in+human+alveolar+epithelial+a549+cells.">Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).</li></ol>

En este manuscrito, se describe un método para generar líneas de células estables de HT29-DR3. Las células HT29-DR3 son un modelo para el estudio de los mecanismos moleculares por los cuales DR3 contribuye a la apoptosis inducida por agentes antimitótica. Este enfoque es versátil y repetible. Para garantizar el éxito del procedimiento, cuatro pasos claves del protocolo necesitan ser considerados. En primer lugar, con el fin de producir un alto suficiente título de virus, se recomienda realizar la transfección de...

Expresión de genes heterólogos se emplea a menudo para estudiar la función de los genes de interés. Dos métodos, transfección transitoria y estable, se utilizan predominantemente en las células y biología molecular para insertar un segmento de ADN o ARN en un anfitrión célula1,2. Transitorio transfected ADN o ARN no puede transmitirse a células de la hija, por lo que la alteración genética puede conservarse sólo durante un período corto de tiempo. Por otra parte, en las células transfected estable, genes exógenos se integran en el genoma de la célula anfitrión, mantener su expresión en la línea celular. Así, la transfección estable es un método que generalmente se reserva para la investigación en la regulación genética a largo plazo. La línea celular estable también puede trasplantarse como xenoinjertos en modelos de ratón in vivo de estudio3. Transfección estable puede dividirse en dos categorías: virales y nonviral. En comparación con transfección nonviral, infección viral puede transferir genes en una variedad más amplia de células humanas con una mayor eficiencia4,5,6,7. Además, una línea celular estable de un solo clon ofrece la ventaja de la homogeneidad y pureza clonal.
División y crecimiento incontrolados de células son las más características del cáncer. En ajustes clínicos, agentes antimitótica son los tratamientos principales para muchos tipos de tumores8. Sin embargo, no se puede ignorar algunas limitaciones significativas de agentes antimitótica. En primer lugar, estas quimioterapias también pueden matar a las células normales junto con las células cancerosas no deseadas y, por lo tanto, pueden resultar en efectos secundarios graves8. Segundo, antitubulin medicamentos no son eficaces contra todos los tipos de tumores, a pesar de expresión ubicua de la tubulina en una amplia variedad de diferentes tejidos como una proteína citoesquelética9,10. No está claro porqué antitubulin agentes mostraron eficacia prometedora contra el ovario, pulmón y cánceres hematológicos en el tratamiento clínico, pero no en riñón, colon y los cánceres de páncreas11. Por último, incluso los pacientes con el mismo tipo de tumor pueden responder a las antimitotics diferentemente de una manera impredecible. Puede haber una molécula efectora clave que afecta a la sensibilidad de diferentes pacientes a agentes antimitótica, dando por resultado los diversos resultados en el tratamiento clínico12. Por lo tanto, la potencial sensibilidad diferencial de los pacientes al tratamiento antimitótica debe tenerse en cuenta para optimizar las intervenciones terapéuticas13.
Una pantalla de biblioteca de siRNA de todo el genoma de alto rendimiento demostró que DR3 caída puede hacer sensibles células resistentes a drogas antimitótica, implicando un papel para DR3 en la apoptosis inducida por la quimioterapia14. Como miembro de la superfamilia de receptores (TNFR) factor de necrosis tumoral, DR3 se ha divulgado para mediar la apoptosis de las células en varios sistemas15,16,17,18. Así pues, nos propusimos establecer líneas celulares estables overexpressing DR3 para estudiar los mecanismos moleculares por el cual droga antimitótica induce apoptosis. Un modelo de celular adecuado para el estudio de sobreexpresión de DR3 se puede proporcionar por la línea de celular del cáncer de colon humano HT29, que fue encontrado para ser DR3-deficiente. Además, en la clínica, cánceres de colon son insensibles a fármacos antimitótica19.
En este artículo, describimos un método que permite la generación de una línea celular estable de HT29-DR3 a través infección retroviral. Además mostramos cómo validar la expresión DR3 en estas células mediante western blot y cómo evaluar la sensibilidad a agentes antimitótica mediante un análisis de viabilidad de la célula y la observación morfológica. Las células son amplificadas de clones individuales y, por lo tanto, tienen la ventaja de un fondo genético homogéneo. Además, la etiqueta de la bandera en DR3 permitido para la visualización de DR3 celular por microscopia y análisis de la gene expresión y proteína interacción por métodos bioquímicos. Además, las células pueden ser investigaciones en ratones para analizar la progresión del tumor en respuesta a antimitotics en vivo14.
El sistema de células HT29-DR3 presentado aquí ofrece una herramienta efectiva para estudiar los mecanismos moleculares de cómo antimitotics matar células de cáncer14. Puesto que la sobreexpresión y líneas celulares de precipitación son herramientas comunes para estudiar la función genética, este protocolo puede ser adaptado fácilmente a otros genes de interés o de otras líneas celulares y, así, se convirtió en un método ampliamente utilizado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C11965500BT</td>
			<td>Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMXs-IRES-Blasicidin</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RTV-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14190500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse secondary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT29 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plat-A cell line</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning Cylinder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT3MV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX53 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plates</td>
			<td>Nest</td>
			<td>712001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture plates</td>
			<td>Nest</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m steril filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well White Polystyrene Microplate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western ECL Substrate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>ImageQuant LAS 4000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decoloring Shaker&#160;</td>
			<td>HINOTECH</td>
			<td>TS-2000A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-bl-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>TC 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing cell lines overexpressing dr3 to assess the apoptotic response to anti-mitotic therapeutics

Estudiar la función de un gen de interés se logra mediante la manipulación de su nivel de expresión, como su expresión con líneas celulares de sobreexpresión de aumentando o disminuyendo su expresión con líneas celulares de precipitación. Transfección transitoria y estable son dos métodos que se utilizan para la expresión de genes exógenos. Transitorios de la transfección sólo es útil para la expresión a corto plazo, mientras que la transfección estable permite genes exógenos a integrarse en el genoma de la célula huésped donde se se expresa continuamente. Como resultado, la transfección estable se emplea generalmente para la investigación en regulación genética a largo plazo. Aquí describimos un protocolo simple para generar una línea celular estable overexpressing muerte etiquetado receptor 3 (DR3) para explorar la función DR3. Seleccionamos clones solo después de una infección retroviral para mantener la homogeneidad y la pureza de las líneas celulares estables. Las líneas celulares estables generadas mediante este protocolo representan células HT29 DR3-deficiente sensibles a drogas antimitótica, reconstituyendo así la respuesta apoptótica en células HT29. Además, la etiqueta de la bandera en DR3 compensa la falta de buena anticuerpo DR3 y facilita el estudio bioquímico del mecanismo molecular por el cual agentes antimitótica inducen apoptosis.

Una caracterización de las células HT29 estable expresaban DR3 se muestra en la figura 1. Los clones expresan diferentes niveles de DR3, mientras que las células de tipo salvaje, que sirven como un control negativo, no muestran expresión de genes exógenos. Aquí sólo mostramos cinco clones, entre los que la copia 1 y 5 expresa el máximo nivel de DR3. Elegimos clon 1 y 5 para los siguientes experimentos.
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Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Establecimiento de líneas de células Overexpressing DR3 para evaluar la respuesta apoptótica a la terapéutica anti-mitotic

Estableciendo una línea estable de células overexpressing un gen de interés para el estudio de funciones de los genes puede hacerse estables recogida de transfección clones solo después de la transferencia de ellos a través de la infección retroviral. Aquí mostramos que las líneas de celulares HT29-DR3 generadas de esta manera dilucidar los mecanismos por el cual la muerte receptor 3 (DR3) contribuye a la apoptosis inducida por antimitotics.

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

La sobreexpresación de genes en las células es una forma importante de estudiar la función génica. La transfección estable con el retrovirus permite que los genes endógenos se integren en el genoma del huésped y se expresen continuamente. Recogimos colonias individuales de la infección retroviral y generamos líneas celulares estables sobreexpresando LA DR3 con flagrante.Las líneas celulares compensaron la indisponibilidad de un buen anticuerpo DR3 y proporcionaron excelentes herramientas para el estudio de la función DR3 post in vitro e in vivo. Generamos las líneas celulares de sobreexpresión de DR3 recogiendo una sola colonia de la infección retroviral. Las líneas celulares de una sola colonia podrían mantener la homogeneidad y pureza.Además, el protocolo es fácil y fácil de manejar. Para comenzar este procedimiento, haga crecer las células plat-A durante la noche en platos de 60 milímetros con cuatro mililitros de DMEM. Cuando las células alcanzan el 80 al 90%confluencia, utilice el reactivo de transfección para transfeczarlas con dos microgramos del plásmido construido como se describe en el manual del fabricante.Después de 72 horas, recoge el sobrenadante. Usando un filtro estéril de 0,45 micrómetros, filtre el medio y mantenga la suspensión viral en la oscuridad a cuatro grados centígrados. A continuación, cultivar células HT29 durante la noche en un plato de 60 milímetros con DMEM, incubando las células a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.Cuando las células alcanzan entre el 30 y el 50% de confluencia, infectarlas con dos mililitros de suspensión viral en presencia de ocho microgramos de polibreno por mililitro de suspensión viral. Incubar las células infectadas a 37 grados centígrados durante cuatro a seis horas. Luego, aspira la suspensión viral.Agregue cuatro mililitros de DMEM fresco y devuelva el plato a la incubadora. A las 24 horas después de la infección, retire los medios de comunicación de los platos y lave cuidadosamente las células con dos mililitros de PBS precalentó. Añadir un mililitro de trippsina EDTA, e incubar las células a 37 grados Celsius durante tres minutos.Usando un microscopio a 10 veces el aumento, observe las células para asegurarse de que la mayoría de ellas se han desprendido. Después de esto, agregue dos mililitros de DMEM que contengan 10%FBS para detener la tripsinanización, y recoja la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros. Centrifugar a 200 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente, y retire el sobrenadante.Vuelva a suspender el pellet celular en 10 mililitros de DMEM y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. A continuación, diluya las células por factores de 30, 100 y 300. Las semillas son platos de 150 milímetros que contienen cada uno de 20 mililitros de DMEM que contiene blasticidina a una concentración de un microgramo por mililitro.Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente una o dos semanas. Durante este período, utilice un microscopio invertido a 10 veces el aumento para observar las colonias cada día. Marque las colonias bien aisladas en la parte inferior del plato cuando el diámetro de las colonias sea de aproximadamente uno a dos milímetros.Una vez finalizado el período de incubación, aspirar el medio y lavar las células con tres mililitros de PBS precalentó. Agregue dos mililitros de tripps EDTA en un plato de 60 milímetros. Utilice fórceps estériles para recoger cilindros de clonación estériles autoclavados y colóquelos en el plato.A continuación, recoger los cilindros que ahora contendrán aproximadamente 30 microlitros de trippsina EDTA, y colocarlos suavemente sobre las colonias marcadas. Devuelva el plato a la incubadora durante tres minutos. Después de esto, revise las células bajo un microscopio para asegurarse de que se han desprendido.Cuando las células se han levantado, a 70 microlitros de cultivo medio a cada cilindro para inactivar la tripina. Utilice una pipeta de 200 microlitrotro para mezclar suavemente la suspensión celular, asegurándose de no mover el cilindro mientras se mezcla. Colocar dos placas de 24 pozos, y etiquetarlas la placa A y la placa B.Añadir un mililitro de DMEM a cada pozo.Añadir 30 microlitros de suspensión celular a cada pozo de la placa A, y añadir 70 microlitros a los pozos correspondientes de la placa B.Coloque las placas de nuevo en la incubadora. Cuando las células de la placa B estén al 90% de confluencia, retire los medios y lave cuidadosamente las células con un mililitro de PBS. Se eliminó el PBS completamente, y agregue 50 microlitros de 1X SDS-PAGE buffer de carga paralyse las celdas.Después de cinco minutos, transfiera el lysate de la célula de la placa de 24 pozos a tubos centrífugos de 1,5 mililitros. Hierva las muestras a 100 grados centígrados durante 10 minutos. Ejecute las muestras en gel 10%SDS a una tensión constante de 80 voltios durante 15 minutos y luego a 120 voltios durante una hora.A continuación, transfiera la proteína a una membrana de fluoruro de polivinilideno mediante transferencia húmeda a una corriente constante de 400 miliamperios durante dos horas. Diluir el anticuerpo primario por un factor de 5.000 en 5% de leche sin grasa que se disuelve en TBST. Añadir el anticuerpo FLAG a la membrana, e incubar a cuatro grados Celsius durante la noche.Con una coctelera decolorante ajustada a 200 RPM, lave la membrana con TBST durante 15 minutos, refrescando el TBST cada cinco minutos. Luego, diluir un anticuerpo secundario antiratón por un factor de 10.000 en 5% de leche sin grasa. Incubar la membrana con anticuerpo secundario diluido a cuatro grados centígrados durante cinco a seis horas.Lave la membrana en la coctelera decolorante de nuevo como se describió anteriormente. Después de esto, utilice la quimiuminescencia mejorada occidental y un sistema de documentación de gel para tomar imágenes de la membrana y detectar la expresión FLAG. En primer lugar, recoja las células HT29 y HT29-DR3 por la tripsinsticación y utilice un contador de celdas automático para medir la densidad de la celda.Siembra las células en los pozos de placas de 12 pozos con DMEM a una densidad de 30.000 células por pozo, e incuba durante la noche a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, agregue 10 nanomolares de diazonamida a cada pozo que contenga células usando 1%DMSO como control negativo, y transfiera las placas a una incubadora a 37 grados Celsius con 5%dióxido de carbono. Después de 48 horas de tratamiento, imagine las células bajo un microscopio a 10 veces el aumento.A continuación, sembrar células HT29 y HT29-DR3 en los pozos de placa de 96 pocillos con DMEM a una densidad de 3.000 células por pozo, y permitirles crecer a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, agregue las concentraciones de diazonamida que aumentan la dosis como se describe en el protocolo de texto. Después de 48 horas de tratamiento, utilice un kit de ensayo de viabilidad celular basado en luminiscencia para medir la viabilidad celular.Retire la placa de 96 pozos de la incubadora y déjela reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Luego, agregue 50 microlitros de reactivos de ensayo a cada pozo, y agite la placa durante dos minutos a temperatura ambiente para anlicenciar las células. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos, y luego utilizar un lector de microplacas para determinar la luminiscencia de cada pozo.La caracterización de las células HT29 que expresan de forma estable la DR3 revela que los clones expresan diferentes niveles de DR3, mientras que las células de tipo salvaje no muestran expresión génica exógena. Los genes uno y cinco se ven para expresar los niveles más altos de DR3, por lo que se eligen para otros experimentos. La morfología de las células HT29 y HT29-DR3 se observa después de ser tratada durante 48 horas con diazonamida.Las células HT29-DR3 muestran apoptosis obvia con una membrana celular rota y desechos celulares. Sin embargo, las células HT29 solo muestran un arresto mitótico con células intactas que exhiben una forma de célula redondear hacia arriba. La viabilidad celular de estos tipos celulares se determina después de ser tratada durante 48 horas con tres nanomolares de diazonamida.Se observa que las células HT29-DR3 tienen una muerte celular de más del 80%, mientras que las células HT29 parentales demuestran sólo una ligera respuesta en forma de detención mitótica. Esto indica que la sobreexpresión de DR3 reconstituyó la vía apoptótica inducida por diazonamida en estas células. Las diluciones seriales adecuadas son importantes para obtener una densidad óptima de clones individuales.También es importante asegurarse de que cada cilindro clon solo contenga una colonia y evitar contaminar las colonias cercanas. Las líneas celulares sobreexpresantes de DR3 facilitaron el estudio bioquímico de los mecanismos moleculares in vitro. Generamos xenoinjertos HT29-DR3 a través de la inyección subcutánea de células HT29-DR3, y ayudó a elaborar los mecanismos de apoptosis in vivo inducida por agentes antimitóticos inglés.Este protocolo se puede utilizar para estudiar genes de interés en otras líneas celulares. Además, el nocaut genético es otra forma de estudio funcional, y nuestro protocolo se puede adaptar a los sistemas de derribo genético. Por lo tanto, es generalmente aplicable a las funciones genéticas de aclarado.Recuerde dejar el relé del virus en la basura a contenedores específicos para su eliminación de seguridad.

Research

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Cancer Research

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