Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma at JoVE.com

س-ب. ن. و A.D.J. معتمدة من قبل وزارة الصحة في "سنغافورة الوطنية الطبية المجلس الانتقال الجوائز البحثية" (نمرك/تا/0020/2013 ونمرك/تا/0052/2016). يعترف الكتاب "منحة بحثية يون سيو يونغ" إلى A.D.J. من "جامعة سرطان معهد سنغافورة الوطنية" نحو شراء مجهر التصوير الطيفي فكترا. وافقت هذه الدراسة "سنغافورة NHG المجال محددة استعراض المجلس ب" (2014/00693).

وتم الحصول على جميع الأنسجة المستخدمة في هذا البروتوكول قيد "سنغافورة NHG المجال محددة استعراض المجلس ب" دراسة 2014/00693.
1-التحديد والتحقق من صحة من الأجسام المضادة
ملاحظة: قبل الشروع في إنشاء أي فريق متعدد، تأكد من أن جميع الأجسام المضادة وصمة قوة، تحديد فقط مستضد ...

<ol>
	<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+revision+of+the+World+Health+Organization+classification+of+lymphoid+neoplasms.">The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms.</a> Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).</li><li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).</li><li>Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+for+Pathologists:+Protocols,+Pitfalls,+and+Tips.">Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+profiling+of+lymphoma.">Immunohistochemical profiling of lymphoma.</a> Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).</li><li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues.">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li><li>Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+Quantitative+Analysis+of+Protein+Expression.">Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Visualization+of+Multiple+Antigens+with+Tyramide+Signal+Amplification+using+Antibodies+from+the+same+Species.">Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Ng, S. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+a+Multiplexed+Immunofluorescence+Panel+in+T-Cell+Lymphoma.">Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma.</a> SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).</li><li>Bogusz, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+large+B-cell+lymphoma+with+concurrent+high+MYC+and+BCL2+expression+shows+evidence+of+active+B-cell+receptor+signaling+by+quantitative+immunofluorescence.">Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).</li><li>Kalyuzhny, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).</li><li>Bordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+validation.">Antibody validation.</a> BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual. , (2012).</li><li>Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+beyond+P+values:+Everyday+data+analysis+with+estimation+plots.">Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+Imaging+of+T+and+B+Cells+in+Murine+Spleen+and+Tumor.">Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor.</a> The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).</li></ol>

وسط المدينة لديه القدرة على تمكين أخصائيي علم الأمراض لصقل دياجنوستيككريتيريا في علم الأمراض اللمفاوية وتحليل دور المؤشرات الحيوية في أنواع الخلايا المحددة تجاه تنبؤ بالنتائج السريرية. كأسلوب جديد في بحث، يتم تطبيق وسط المدينة متزايدة إلى تحديد الكمية والمكانية لمعلمات متعددة محصنة من...

الأورام اللمفاوية بسبب انتشار الخلايا الليمفاوية الخبيثة غير المنضبط. هذه الخلايا هي عناصر حيوية في الجهاز المناعي، وتعريب لأجهزة المناعة الأولية والثانوية، مثل نخاع العظام والعقد الليمفاوية والطحال ونظام اللمفاوية الأخرى المرتبطة بالغشاء المخاطي. الأورام اللمفاوية هي مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات التي تصنف استناداً إلى كوكبة من الميزات، بما في ذلك مورفولوجيا، إيمونوفينوتيبي، والسمات الوراثية، والعرض التقديمي السريرية. بينما يلعب كل معلمة جزء، النسب ما زالت سمة المميزة ويشكل الأساس لنظام تصنيف منظمة الصحة العالمية التي تعترف بالأورام المستمدة من الخلايا ب وخلايا T القاتلة الطبيعية (ناغورني كاراباخ) الخلايا1.
وكان مفتاح للتصنيف للأورام اللمفاوية توصيف الأجسام المضادة ضد علامات سطح الكريات البيض من الأنواع الفرعية المختلفة للخلايا الليمفاوية2. إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) قد استخدم تقليديا لتحليل مثل هذه العلامات، ويستند إلى مبدأ الاعتراف ضد مستضد محدد للكشف عن الجزيئات المستندة إلى الخلايا والأنسجة التي يمكن تصور من خلال المجهر الخفيفة 3. بيد أن تحديد أهداف متعددة على شريحة واحدة من التقليدية مشرق حقل المدينة متعدد اللونية بقيود لأنه غالباً ما يصعب التمييز بين إشارات متعددة الألوان على مقطع نسيج واحد موثوق بها، لا سيما لمولدات المضادات مع تعبير منخفضة جداً4. التقييم البصري والتحديد الكمي لتلطيخ أيضا يمكن أن تكون ذاتية، تسبب تقلب في تفسير البيانات وتحليل5.
ولذلك، المدينة التقليدية على عينات (FFPE) الفورمالين--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين ليس عمليا للكشف عن واحد من أهداف متعددة في أمراض متنوعة مناعي مثل الأورام اللمفاوية. وعلاوة على ذلك، التمييز بين الخلايا الليمفاوية الورمية من الخلايا المناعية المحيطة غالباً غير دقيقة. وهذا يعوق دراسات تبحث في أهمية المؤشرات الحيوية الرواية في الأورام اللمفاوية. وفي هذا السياق، يقدم المدينة الفلورسنت متعدد (وسط-المدينة) بديلاً واعداً كما أنها تتيح التقييم الكمي مستضد كوكسبريشن وعلاقة مكانية بدقة أعلى مع المحافظة على محدودية العينات6،7- عندما هذا تكنولوجيا التصوير هو في شراكة مع برنامج تحليل الصور الرقمية، تفسير البيانات أكثر كفاءة ويسهل دراسة الأورام والمكرويه التغايرية8،9. في هذا البروتوكول، أساس تيراميدي الفلورة (إذا كان) الإرسال المتعدد الأسلوب يتم تطبيقه على تضخيم الإشارات وهو متوافق مع أي جسم التحقق من صحة المدينة من أي الأنواع المضيفة، حتى تلك التي وضعت في نفس الأنواع5،7 , 10-يسمح البروتوكول على أساس تيراميدي لتصريف fluorophore لانسجة الاهتمام المباشر بحيث يمكن تجريده جسم الابتدائي والثانوي بعد كل خطوة، يسمح بتطبيق متسلسلة من البقع متعددة دون جسم ه.
استراتيجية متعدد ستكون مفيدة للتنبؤ بنتائج التشخيص والعلاج عن طريق تحديد الأهداف وأنماطها المناعية البديل في الأورام الليمفاوية. متعدد الفلورسنت المدينة قد طبقت في لدينا مختبر لدراسة فريق من علامات مساعد تي الحبيبي في أنجيويمونوبلاستيك تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية (أيتل)، وعلامات تي وب اللمفاويات نوع فرعي الأورام اللمفاوية تي خلية الطرفية تتسم بالعدوانية السريرية السلوك والورم التغايرية11. ويتضح مدى فائدة هذا الأسلوب أيضا اللمفاوية ب-الخلايا الكبيرة منتشر (DLBCL)، مما يشير إلى زيادة في مستقبل خلايا ب مع التعبير المتزامن ج-حركة و BCL-2 تقترح فيها استخدام العلاجية المحتملة تيروزين كيناز تثبيط لبروتون 12 . 
هنا يمكننا وصف بروتوكول كامل من التحقق من صحة جسم اختيار عنصر التحكم المناسب الأنسجة ومضاعفة استخدام لمفوما FFPE الآلي الأنسجة، مع تحليل في نهاية المطاف للشرائح ملطخة باستخدام المسح التصوير الكمي في علم الأمراض النظام.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>REF S3022</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>For peroxide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra multispectral automated microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Vectra2.0.8</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1135</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF822001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF812001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL6</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-MYC</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy 5</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1171</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>Graph pad</td>
			<td></td>
			<td>Statisitcal software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoClear Clearing Agent</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H2779-1L</td>
			<td>Histoclear for dewaxing and clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced 
			Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Inform Software 2.2.1</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI67</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOS MILESTONE multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone</td>
			<td></td>
			<td>Microwave for Heat induced epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>PANASONIC</td>
			<td>NN-ST651M</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>81381 Aldrich Mowiol&#174; 4-88</td>
			<td>mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1488</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal520</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1487B21</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal540</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1494</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal620</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1495</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for tissue section adhesion in routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2367</td>
			<td>For HIER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer saline (TBS)</td>
			<td>1st BASE</td>
			<td>BUF3030 20X4L</td>
			<td>for buffer wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td>Tween</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma

أساليب المناعي (المدينة) لتحليل التعبير البروتين بالفحص المجهري الخفيفة في الموقع أداة قوية للبحث وأغراض التشخيص. ومع ذلك، التصور والتقدير الكمي لمولدات المضادات المتعددة في مقطع واحد من أنسجة استخدام المدينة اللونية التقليدية يمثل تحديا. التصوير متعدد مهم خصوصا في أبحاث سرطان الغدد الليمفاوية، والتشخيص، حيث علامات يجب أن تفسر في سياق معقدة وورم المكروية. هنا يصف لنا وضع بروتوكول للمدينة الفلورسنت متعدد تلطيخ لتمكين التقييم الكمي لأهداف متعددة في خلية معينة أنواع المصالح في الأورام اللمفاوية. الأسلوب الذي يغطي جوانب من التحقق من صحة جسم، والأجسام المضادة الأمثل، الأمثل متعدد مع علامات لمفوما الأنواع الفرعية، تلطيخ الأنسجة الشرائح ميكرواري (تي أم أية)، ومسح الشرائح، متبوعاً بتحليل البيانات، مع محدد إشارة إلى سرطان الغدد الليمفاوية. باستخدام هذا الأسلوب، يتم إنشاء عشرات لكل شدة يعني علامة على الاهتمام والإيجابية النسبة المئوية تيسير المزيد من التحليل الكمي. الإرسال المتعدد يقلل استخدام العينة، ويوفر المعلومات المكانية لكل علامة للفائدة.

صور وسط المدينة عينة DLBCL مع ج-حركة وإعادة ترتيب الجينات BCL2 (مزدوج--ضرب سرطان الغدد الليمفاوية) يرد في الشكل 1. ويبين الشكل 2 الصور محاكاة مشرق الميدان المناعي. يشير الرقم 3 إلى توليد بيانات النسبة المئوية. يعرض الرق...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma at JoVE.com

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

هنا يمكننا وصف بروتوكول متعدد المناعي الفلورسنت تلطيخ والتصوير للترجمة المتزامنة متعددة المستضدات المرتبطة بالسرطان في الأورام اللمفاوية. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لتحليل المؤشرات الحيوية داخل جميع أقسام الأنسجة كولوكاليزيشن.

متعدد الفلورسنت المناعي تلطيخ والتصوير والتحليل في عينات نسيجية من سرطان الغدد الليمفاوية

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

الأورام اللمفاوية هي أورام معقدة من الناحية النسيجية. لذلك ، يوفر الكيمياء المناعية الفلورية متعددة الفلورسنت مزايا أكثر من الكيمياء المناعية التقليدية الملونة لدراسة علامات الاهتمام في الخلايا السرطانية و البيئة الدقيقة. هذه التقنية لديها القدرة على توحيد التهديف من الأجسام المضادة القائمة على تلطيخ في عينات الغدد الليمفاوية النسيجية، وهي العملية التي كانت تاريخيا تحديا بسبب تعقيد البيئة الدقيقة الورم.على وجه التحديد، متعدد الفلوريسسينت المناعية والتصوير الطيفي يسمح القياس الكمي من بقع متعددة داخل شريحة واحدة، مما يسمح بتقييم التعبير المشترك المستضد والعلاقة الزبيسية داخل المواد السريرية. تبدأ من خلال غمر الشرائح دي مشمع وإعادة تهيئي في مخزن استرداد المستضد القياسية في جرة الزجاج حفظ الميكروويف وأداء الحرارة الناجمة عن استرجاع epitope في الميكروويف مناسبة. تنفيذ جولات إضافية من تجريد الميكروويف على أساس موقف الجسم المضاد في تسلسل متعدد النهائي.على سبيل المثال، يتطلب الجسم المضاد الرابع ثلاث جولات إضافية من تجريد الميكروويف قبل تلطيخ. بعد الانتهاء من عملية تجريد، واستخدام ملقط وقفازات واقية من الحرارة لنقل الشرائح إلى الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة على الأقل تهدئة. عندما يبرد محلول استرجاع المستضد ، قم بحظر نشاط بيروكسيديز الأنسجة مع كتلة بيروكسيديز التجارية لمدة 10 دقائق تليها غسل لمدة خمس دقائق في محلول ملحي مخزن بالتراين ، أو TBS ، ومنظفات غير أيونية.كتلة أي تلطيخ غير محدد مع حضانة 10 دقيقة في منع العازلة تليها الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية من الفائدة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة وثلاثة خمس دقائق يغسل مع TBS-D العازلة. بعد ذلك ، احتضان العينات مع جسم مضاد ثانوي مناسب من الفجل peroxidase لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تليها ثلاثة يغسل في عازلة TBS-D كما هو موضح. بعد الغسيل الأخير، وتطبيق المشعاع التيراميد المناسبة القائمة على الشرائح لحضانة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة تليها ثلاثة خمس دقائق TBS-D يغسل.تنفيذ عملية تجريد إضافية على الموجات الدقيقة لإزالة الأجسام المضادة الأولية والثانوية في محلول استرجاع مستضد جديد كما هو موضح. في نهاية الاسترجاع، يبرد الشرائح في الماء المقطر ويجفف المناطق على الشرائح بدون أنسجة مع مناديل معملية. احتضان الشريحة مع dappy لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تليها ثلاثة يغسل TBS-D.ثم، قم بتجفيف الشرائح بعناية باستخدام مناديل المختبر دون الاتصال بالأنسجة وقم بتركيب العينات مع وسيلة مناسبة للتصوير. بالنسبة لمسح الشريحة أحادية الضفير، حدد الفلاتر المناسبة من الفلوروفهورات المستخدمة في وضع العلامات على العينات وفحص كل علامة وقناة الفلورسينس المقابلة لتحديد وقت التعرض المناسب للحصول على إشارة نظيفة، مع التركيز على مكون الأنسجة الذي يجب أن يكون له أقوى إشارة للعلامة. للسماح بالمقارنة بين العينات بين كثافة البكسل، استخدم إعداد الكاميرا المباشرة لضبط وقت التعرض في كل قناة على حدة حتى لا تكون هناك مناطق مكشوفة في صورة الكاميرا المباشرة.عندما يتم مسح جميع الشرائح، الحصول على صور حقل مشرق محاكاة لمقارنتها بصريا مع نمط المناعة الطبيعية وتحديد ما إذا كان نمط تلطيخ هو الصحيح. لمسح شرائح ميكروراي الأنسجة، استخدم وضع المسح الضوئي للميكروراي في نظام التصوير و خوارزمية التركيز التلقائي المناسبة. بالنسبة للشرائح المقطعية للأنسجة الكاملة، قم بمراجعة الشرائح من قبل أخصائي أمراض مؤهل لتحديد الصور المثلى من مناطق الأورام الأكثر تمثيلاً.قبل البدء في التحليل، حدد علامة ورم لتحديد الخلايا التي تهم التحليل. واطلب أخصائي علم الأمراض مراجعة الصور وقرر ما إذا كان هناك حاجة إلى تجزئة الأنسجة. إذا لزم الأمر، حدد مناطق التحكم المناسبة للتجزئة وتحقق مما إذا كان برنامج تحليل الصور يمكنه التعرف على هذه المناطق بشكل صحيح.بعد تجزئة الخلية، يكون أخصائي علم الأمراض مراجعة خريطة تجزئة لضمان دقة نهج التجزئة المقصود ومراجعة الصور الفردية لتحديد ما إذا كان تقسيم الخلية كافية أو إذا كان هناك حاجة إلى تقسيم الأنسجة إضافية لتحديد المناطق المخصب للخلايا السرطانية، stroma، أو نخر. ثم تحديد قيمة قطع كثافة الضوئية إيجابية لكل علامة بالاقتران مع الطبيب الشرعي وتوليد المدرج التكراري في برنامج الإحصاء المناسب لتحليل توزيع التردد من كثافة علامة لكل خلية. لإنشاء بيانات النسبة المئوية لعلامات معينة ذات أهمية داخل الخلايا المحددة، قم بإدراج جدول محوري في ورقة البيانات وحدد Sum لحساب النسبة المئوية للإيجابية لعلامة فائدة واحدة.سيتم حساب العدد الإجمالي للخلايا الموجبة للعلامة مقسومًا على العدد الإجمالي. والنتيجة هي النسبة المئوية للنسبة المئوية للنسبة الإيجابية للخلية مع نواة واحدة، أو رقم دراسة واحد. لتوليد بيانات رقمية، الحصول على متوسط كثافة كل علامة الاهتمام في جميع الخلايا دراسة داخل عينة لاستخراج متوسط عدد تطبيع لكل علامة من كل رقم الأساسية أو الدراسة.هنا، يتم عرض صور متعددة الفلورسنت مناعية متعددة الفلوريولوجية لعينة سرطان الغدد الليمفاوية B-الخلية الكبيرة المنتشرة مع c-MYC و BCL2 الجينات إعادة ترتيب. محاكاة مشرق مجال المناعة المناعة الصور تدل على نمط وصمة مماثلة علامة الورم. تطبيق الصور متعددة الفلورسنت المناعية الفلورية على لوحة الخلايا التائية في الأورام اللمفاوية الخلايا التائية angioimmunoblastic يكشف عن عدم تجانس الخلية من عينة الورم.هنا، يتم عرض الأمثل لعينة التحكم اللوزتين وتحليل البيانات الناتجة. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من برامج تحليل الصور بعد الخطوة غير المحيرة إلى التعبير الكمي لعلامة وتوطين في الخلايا السرطانية والورم microenvironment. هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين لدراسة التعبير المشترك من علامات متعددة داخل أنواع خلايا محددة في أقسام الأنسجة المفردة من سرطان الغدد الليمفاوية.الحرص على منع الإصابة الناجمة عن الحرارة أثناء خطوات microwaving وتكون على بينة من مخاطر السقوط أثناء خطوات المسح الضوئي التي يتم تنفيذها في سطح السفينة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

اشتقاق خطوط التوتة تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية من أجهزة الصراف الآلي -- / --</sup و البروتين p53 -- / --</sup الفئران

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

نيون استخدام الكيمياء المناعية للكشف عن الإدواردسيلة ictaluri في سمك السلور قناة ( أولا punctatus) عينات

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

كشف متعددة من البكتيريا الموجودة في مجمع العينات السريرية والبيئية باستخدام قليل النوكليوتيد ، بالإضافة نيون المجهرية

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

غير الغازية<em&gt; في فيفو</em&gt; الإسفار التصوير البصري من مب النشاط التهابات باستخدام عامل التصوير الفلورسنت أكتيفاتابل

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

عالية متعددة، والتصوير فائقة الدقة من الخلايا T باستخدام مادستورم

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

استخدام كبسولات لالتلطيخ السلبي من العينات الفيروسية ضمن بيوكنتينمنت

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

القياس الكمي نسيجية لتحديد عبء الرئة الفطرية في أسبيرجيلوسيس التجريبية

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

استخدام النظم الآلية للعملية وتضمين Colonic موريني عينات لإجراء تحاليل نسيجية

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

تعزيز مراقبة داء الكلب باستخدام اختبار سريع مباشر للمناعة الكيميائية

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...