Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00
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s. b. n. 和 a. d. j. 得到新加坡卫生部国家医学研究委员会过渡奖 (nmrc/2013 和 nmrc 00.塔/00 2016) 的支持。作者承认新加坡国立大学癌症研究所向 a. d. j. 提供的用于购买 vectra 光谱成像显微镜的永秀 yoon 研究赠款。这项研究获得新加坡 nhg 领域特定审查委员会 b (2014/00693) 的批准。

该协议中使用的所有组织都是根据新加坡 nhg 领域特定审查委员会 b 的研究获得的, 该研究报告为 201\ 00693。
1. 抗体的选择和验证
注: 在进行任何多路复用面板的建立之前, 请确保所有抗体都能进行有力的染色, 只识别感兴趣的目标抗原。其目的是选择抗体, 特别是承认在组织切片感兴趣的抗原。
<ol><li>对于具有成熟研究用途或在 ihc 中常规临床使用的抗体...

<ol>
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mf-ihc 有可能使病理学家能够改进淋巴病理诊断标准, 并分析生物标志物在特定细胞类型中的作用, 以预测临床结果。mf-ihc 作为一种新的研究方法, 越来越多地应用于肿瘤细胞17的多重免疫参数的定量和空间识别。mf-ihc 检测肿瘤生物标志物的共表达已被证明是可重现和可靠的5。然而, 这项技术仍然是新生的, 并受到由于反应和组织相关因素而产生的变异性, 例如由?...

淋巴肿瘤是由淋巴细胞不受控制的恶性增殖引起的。这些细胞是免疫系统的重要组成部分, 并定位到主要和次要免疫器官, 如骨髓、淋巴结、脾脏和其他黏膜相关的淋巴系统。淋巴肿瘤是一种异质性疾病, 根据包括形态学、免疫表型、遗传特征和临床表现在内的一系列特征进行分类。虽然每个参数都有一定的作用, 但谱系仍然是一个决定性的特征, 并构成世卫组织分类系统的基础, 该系统识别来自 b 细胞、t 细胞和自然杀伤细胞1的肿瘤。
淋巴瘤分类的关键一直是对白细胞表面标记抗体的鉴定, 对淋巴细胞的各种亚型2。免疫组织化学 (ihc) 传统上被用于分析此类标记, 并基于特定的抗原抗体识别原理, 以检测可通过光学显微镜显示的细胞和组织分子3. 然而, 传统的光场显色多体 ihc 在单个幻灯片上识别多个目标有局限性, 因为通常很难可靠地区分单个组织部分上的多个颜色信号, 尤其是对于具有很低表达的抗原4。对染色进行视觉评估和定量也可能是主观的, 导致分析和数据解释的可变性5。
因此, 传统的 ihc 在福尔马林固定, 石蜡嵌入 (ffpe) 样品是不可行的同时检测多个目标的免疫多样化的疾病, 如淋巴瘤。此外, 区分肿瘤淋巴细胞和周围的免疫细胞往往是不精确的。这阻碍了研究新的生物标志物在淋巴瘤中的相关性。在这种情况下, 多重荧光 ihc (mf-ihc) 提供了一个很有希望的替代方案, 因为它允许定量评估抗原共表达和空间关系的更高的精度, 同时保存有限的样本6,7.当该成像技术与数字图像分析软件结合使用时, 数据解释效率更高, 便于肿瘤和微环境异质性的研究 8,9。在本协议中, 采用了基于类型的免疫荧光 (if) 复用方法来放大信号, 并与任何寄主物种 (即使是在同一物种5、7中开发的) 经过 ihc 验证的任何抗体兼容,10. 基于类型的协议允许荧光体与感兴趣的组织直接结合, 以便在每一步之后都能去除原发抗体和二级抗体, 从而可以连续应用多个污渍没有抗体交叉反应性。
多路复用策略将有助于预测预后和治疗结果, 通过确定目标及其变异的免疫模式在淋巴瘤。多倍荧光 ihc 已在我们的实验室中应用于血管免疫细胞 t 细胞淋巴瘤 (aita) 中 t 和 b 淋巴细胞标记组和 t-滤泡辅助标记的研究, 这是一种具有攻击性临床特征的外周细胞淋巴瘤的亚型行为和肿瘤异质性11。这种方法的效用也说明了弥漫性大 b 细胞淋巴瘤 (dlbcl), 其中 b 细胞受体同时 c-myc 和 bcl-2 表达的信号增加表明布鲁顿酪氨酸激酶抑制的潜在治疗应用12. 
在这里, 我们描述了整个协议, 从抗体验证, 选择适当的控制组织和多路复用使用淋巴瘤 ffpe 组织, 最终分析染色幻灯片使用扫描自动定量病理成像系统。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>REF S3022</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>For peroxide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra multispectral automated microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Vectra2.0.8</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1135</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF822001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF812001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL6</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-MYC</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy 5</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1171</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>Graph pad</td>
			<td></td>
			<td>Statisitcal software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoClear Clearing Agent</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H2779-1L</td>
			<td>Histoclear for dewaxing and clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced 
			Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Inform Software 2.2.1</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI67</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOS MILESTONE multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone</td>
			<td></td>
			<td>Microwave for Heat induced epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>PANASONIC</td>
			<td>NN-ST651M</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>81381 Aldrich Mowiol&#174; 4-88</td>
			<td>mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1488</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal520</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1487B21</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal540</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1494</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal620</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1495</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for tissue section adhesion in routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2367</td>
			<td>For HIER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer saline (TBS)</td>
			<td>1st BASE</td>
			<td>BUF3030 20X4L</td>
			<td>for buffer wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td>Tween</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma

免疫组织化学 (ihc) 方法用于光镜原位分析蛋白质表达, 是研究和诊断的有力工具。然而, 使用常规显色 ic 在单个组织切片中对多种抗原进行可视化和定量是具有挑战性的。多路成像在淋巴瘤的研究和诊断中尤其重要, 在淋巴瘤的研究和诊断中, 标记必须在复杂的肿瘤微环境中进行解释。在这里, 我们描述了多路复用荧光 ihc 染色的协议, 以便能够定量评估淋巴瘤中感兴趣的特定细胞类型中的多个目标。该方法包括抗体验证、抗体优化、淋巴瘤亚型标记物的多重优化、组织微阵列 (tma) 幻灯片的染色以及幻灯片的扫描, 然后进行数据分析, 并具有特定的特征指淋巴瘤。使用这种方法, 产生的平均强度的兴趣标记和百分比阳性产生, 以方便进一步的定量分析。多路复用最大限度地减少了样本利用率, 并为每个感兴趣的标记提供了空间信息。

mf-ihc 图像的 dlbcl 样品与 c-myc 和 bcl2 基因重排 (双击淋巴瘤) 如图 1所示。图 2显示了模拟的光场免疫组织化学图像。图 3显示了百分比数据的生成。图 4显示了生成数值数据的中位公式的详细信息。图 5显示了 t 细胞面板 mf-ihc 在血管免疫细胞 t 细胞淋巴瘤中的应...

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Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

在这里, 我们描述了一个协议的多重荧光免疫组化染色和成像同时定位的多种癌症相关抗原在淋巴瘤。该协议可推广到所有组织切片中生物标志物的共化分析。

淋巴瘤组织学标本中多路荧光组织化学染色、成像与分析

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

淋巴瘤是组织学上复杂的肿瘤。因此，多路复用荧光免疫组织化学比传统的染色原免疫组织化学具有研究肿瘤细胞和微环境感兴趣的标记物的优点。这项技术有可能标准化组织性淋巴瘤样本中基于抗体的染色评分，由于肿瘤微环境的复杂性，这一过程在历史上一直具有挑战性。具体来说，多路复用荧光免疫组织化学和光谱成像允许在一张幻灯片内定量测量多个污渍，从而允许评估临床材料中的抗原共表达和空间关系。首先将去蜡和补水滑梯浸入标准抗原检索缓冲器中，在微波炉中保存玻璃罐，并在合适的微波炉中执行热诱导表位检索。根据抗体在最后多路复用序列中的位置执行额外的微波剥离。例如，第四个抗体在染色前需要三轮额外的微波剥离。剥离过程完成后，使用钳子和防热手套将滑梯在室温下转移到蒸馏水中至少冷却 10 分钟。当抗原检索溶液冷却后，用商业过氧化物酶块阻止组织过氧化物酶活性 10 分钟，然后用三分缓冲盐水（TBS）和非离子洗涤剂洗涤 5 分钟。在阻断缓冲液中用10分钟的孵育阻断任何非特异性染色，然后用在室温下与感兴趣的主要抗体孵育30分钟，用TBS-D缓冲液进行3次5分钟洗涤。接下来，在室温下用适当的马萝卜过氧化物酶结合二次抗体孵育样品15分钟，随后在TBS-D缓冲液中进行三次洗涤，如证明。上次洗涤后，在幻灯片上应用适当的酪酰胺荧光试剂，在室温下孵育五分钟，然后进行三次五分钟 TBS-D 洗涤。执行额外的微波剥离，以去除新鲜抗原检索溶液中的初级抗体和二级抗体，如所证明的。在检索结束时，用蒸馏水冷却幻灯片，然后用实验室湿巾将幻灯片上的区域干燥，无需纸巾。在室温下用dppy孵育幻灯片10分钟，然后进行三次TBS-D洗涤。然后，用实验室湿巾小心干燥幻灯片，无需接触组织，然后用适当的安装介质安装样品以进行成像。对于单面幻灯片扫描，从用于标记样品的荧光波中选择适当的过滤器，并检查每个标记及其相应的荧光通道，以确定获得清洁信号的适当曝光时间，重点是应具有标记最强信号的组织组件。若要允许对像素强度进行交叉采样比较，请使用实时摄像机设置调整每个通道中的曝光时间，直到实时摄像机图像中没有曝光过度区域。扫描所有幻灯片后，获取模拟的明亮场图像，以直观地与正常的免疫石化学模式进行比较，并确定染色模式是否正确。要扫描组织微阵列幻灯片，请使用成像系统中的组织微阵列扫描模式和适当的自动对焦算法。对于整个组织部分幻灯片，请由合格的病理学家检查幻灯片，从最具代表性的肿瘤区域选择最佳图像。在开始分析之前，选择一个肿瘤标记来识别分析感兴趣的细胞。让病理学家检查图像，并决定是否需要组织分割。如果需要，请选择适当的控制区域进行分段，并检查图像分析软件能否正确识别这些区域。细胞分割后，让病理学家检查分割图，以确保预期分割方法的保真度，并审查单个图像，以确定细胞分割是否足够，或者是否需要额外的组织分割来选择富集的肿瘤细胞、频闪和/或坏死的区域。然后与病理学家一起确定每个标记的光学强度正截止值，并在适当的统计软件程序中生成直方图，以分析每个细胞标记强度的频率分布。若要为定义的单元格中的特定感兴趣标记生成百分比数据，请在数据表中插入数据透视表并选择 Sum 以计算单个兴趣标记的积极性百分比。将计算标记正单元格的总数除以总数。结果是标记正细胞百分比与一个核心，或一个研究编号。要生成数值数据，请获取样本中所有细胞研究中每个感兴趣标记的均值强度，以提取每个核心或研究编号的每个标记的中位数规范化计数。在这里，显示了具有代表性的多路复用荧光免疫组织化学图像，用于具有c-MYC和BCL2基因重排的漫射大B细胞淋巴瘤样本。模拟亮场免疫组织化学图像展示了类似的肿瘤标记染色模式。多路复用荧光免疫组织化学图像在血管免疫细胞T细胞淋巴瘤中的T细胞面板上的应用揭示了肿瘤样本的细胞异质性。此处显示了扁桃体控制样本的优化和结果数据分析。各种图像分析软件程序可以在解混步骤后，对肿瘤细胞和肿瘤微环境的标记表达和定位进行量化。这项技术为研究人员研究淋巴瘤单组织部分特定细胞类型中多个标记的共同表达铺平了道路。注意在微摇步过程中防止热引起的伤害，并注意在甲板上执行的扫描步骤中的坠落风险。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

胸腺淋巴瘤的T细胞系的推导 ATM - / -</sup P53 - / -</sup鼠标

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科研

免疫与感染

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

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使用荧光免疫化学检测爱德华ictaluri</em斑点叉尾鮰>（一毛虫）样品

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

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中性粒细胞分离和分析，以确定他们的淋巴瘤细胞的敏感性对治疗药物的作用

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Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

无创<em&gt;体内</em炎性MMP活性的使用可激活荧光成像剂&gt;荧光光学成像

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