Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma at JoVE.com

S.-B.N. og A.D.J. understøttes af Singapore Ministry of Healths nationale medicinske forskning Rådet overgang Awards (NMRC/TA/0020/2013 og NMRC/TA/0052/2016). Forfatterne anerkender Yong Siew Yoon forskning tilskud til A.D.J. fra den nationale Universitet Cancer Institute i Singapore mod køb af en Vectra spektrale imaging mikroskop. Denne undersøgelse er godkendt af Singapore NHG domæne specifikke Review Board B (2014/00693).

Alt væv i denne protokol blev opnået under Singapore NHG domæne specifikke Review Board B studere 2014/00693.
1. udvælgelse og validering af antistoffer
Bemærk: Før du går videre med oprettelsen af enhver multipleksede panel, sørge for at alle antistoffer plette håndfast, at identificere kun målet antigenet af interesse. Formålet er at vælge antistoffer, der specifikt anerkende antigen af interesse i væv sektioner.
<ol><li>For et antistof med en velet...

<ol>
	<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+revision+of+the+World+Health+Organization+classification+of+lymphoid+neoplasms.">The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms.</a> Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).</li><li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).</li><li>Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+for+Pathologists:+Protocols,+Pitfalls,+and+Tips.">Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+profiling+of+lymphoma.">Immunohistochemical profiling of lymphoma.</a> Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).</li><li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues.">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li><li>Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+Quantitative+Analysis+of+Protein+Expression.">Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Visualization+of+Multiple+Antigens+with+Tyramide+Signal+Amplification+using+Antibodies+from+the+same+Species.">Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Ng, S. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+a+Multiplexed+Immunofluorescence+Panel+in+T-Cell+Lymphoma.">Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma.</a> SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).</li><li>Bogusz, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+large+B-cell+lymphoma+with+concurrent+high+MYC+and+BCL2+expression+shows+evidence+of+active+B-cell+receptor+signaling+by+quantitative+immunofluorescence.">Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).</li><li>Kalyuzhny, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).</li><li>Bordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+validation.">Antibody validation.</a> BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual. , (2012).</li><li>Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+beyond+P+values:+Everyday+data+analysis+with+estimation+plots.">Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+Imaging+of+T+and+B+Cells+in+Murine+Spleen+and+Tumor.">Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor.</a> The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).</li></ol>

MF-IHC har potentiale til at aktiverer patologer forfine diagnosticcriteria i lymfoide patologi og analyserer betydningen af biomarkører i specifikke celletyper mod en forudsigelse af kliniske resultater. Som en ny Forskningsmetode anvendes mf-IHC i stigende grad kvantitative og rumlige identifikation af flere immun parametre af tumor celler17. Påvisning af mf-IHC for fælles udtryk for tumor biomarkører har vist sig at være reproducerbare og pålidelig5. Teknologien er...

Lymfoide neoplasmer er forårsaget af ukontrolleret maligne spredning af lymfocytter. Disse celler er vigtige komponenter i immunsystemet og lokalisere til de primære og sekundære immun organer, såsom knoglemarven, lymfeknuder, milt og andre slimhinde-associerede lymfoide system. Lymfoide neoplasmer er en heterogen gruppe af sygdomme, der er klassificeret baseret på en konstellation af funktioner, herunder morfologi, immunophenotype, genetiske egenskaber og klinisk præsentation. Mens hver parameter spiller en rolle, lineage er fortsat et afgørende træk og danner grundlag for WHO-klassifikationssystem, som anerkender neoplasmer afledt af B-celler, T-celler og natural killer (NK) celler1.
Nøglen til klassificering af lymfom har været karakterisering af antistoffer mod leukocyt overflade markører af lymfocytter2forskellige undertyper. Immunhistokemi (IHC) har traditionelt været brugt til analyse af sådanne mærker og er baseret på princippet om den specifikke antigen-antistof anerkendelse at opdage celle - og tissue-baserede molekyler, der kan visualiseres gennem lysmikroskop 3. identifikation af flere mål på et enkelt dias af konventionelle lysfelt kromogent multiplex IHC har imidlertid begrænsninger fordi det er ofte vanskeligt at skelne mellem flere farve signaler på en enkelt væv sektion pålideligt — især for antigener med en meget lav udtryk4. Visuel bedømmelse og kvantificering af farvning kan også være subjektiv, forårsager variabilitet i den analyse og data fortolkning5.
Konventionelle IHC på formalin-fast, paraffin-embedded (FFPE) prøver er derfor ikke muligt for samtidige påvisning af flere mål i immunologisk forskellige sygdomme som lymfom. Desuden er skelne neoplastiske lymfocytter fra de omkringliggende immunceller ofte upræcise. Dette hindrer undersøgelser, der ser på relevansen af roman biomarkører i lymfom. I denne sammenhæng, multiplex fluorescerende IHC (mf-IHC) tilbyder en lovende alternativ, da det giver mulighed for den kvantitative vurdering af antigen coexpression og et rumlige forhold med højere præcision samtidig bevare begrænset prøver6,7. Når denne imaging-teknologi er indgået et samarbejde med digital billed analyse software, data fortolkning er gjort mere effektivt og letter undersøgelsen af tumor og mikromiljø heterogenitet8,9. I denne protokol, en tyramide-baseret immunofluorescens (IF) multiplexing metode anvendes for at forstærke signalet og er kompatibel med enhver IHC-valideret antistof fra enhver vært arter, selv dem, der udvikles i de samme arter5,7 , 10. tyramide-baseret protokol giver mulighed for den direkte konjugering af fluorophore til væv af interesse, således at den primære og sekundære antistof kan fjernes efter hvert trin, giver mulighed for en fortløbende anvendelse af flere pletter uden antistof krydsreaktivitet.
En multiplex strategi vil være nyttige til at forudsige resultater prognose og behandling ved at identificere mål og deres variant immunologiske mønstre i lymfomer. Multiplex fluorescerende IHC er blevet anvendt i vores laboratorium for undersøgelse af et panel af T og B-lymfocytter markører og T-follikulært helper markører i angioimmunoblastic T-celle lymfom (AITL), en undertype af en perifert T-celle lymfom karakteriseret ved aggressiv kliniske adfærd og tumor heterogenitet11. Nytten af denne metode illustreres også i diffus store B-celle lymfom (DLBCL) hvor den øget signalering af en B-celle receptoren med samtidige C-MYC og BCL-2 udtryk tyder på potentiel terapeutisk brug af Brutons tyrosin kinase hæmning 12 . 
Beskriver her vi den hele protokol fra antistof validering til udvælgelsen af passende kontrol væv og multiplexing ved hjælp af lymfom FFPE væv, med en eventuel analyse af bejdset dias ved hjælp af en scanning automatiseret kvantitative patologi imaging system.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>REF S3022</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>For peroxide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra multispectral automated microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Vectra2.0.8</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1135</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF822001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF812001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL6</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-MYC</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy 5</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1171</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>Graph pad</td>
			<td></td>
			<td>Statisitcal software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoClear Clearing Agent</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H2779-1L</td>
			<td>Histoclear for dewaxing and clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced 
			Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Inform Software 2.2.1</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI67</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOS MILESTONE multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone</td>
			<td></td>
			<td>Microwave for Heat induced epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>PANASONIC</td>
			<td>NN-ST651M</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>81381 Aldrich Mowiol&#174; 4-88</td>
			<td>mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1488</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal520</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1487B21</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal540</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1494</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal620</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1495</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for tissue section adhesion in routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2367</td>
			<td>For HIER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer saline (TBS)</td>
			<td>1st BASE</td>
			<td>BUF3030 20X4L</td>
			<td>for buffer wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td>Tween</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma

Immunhistokemiske (IHC) metoder til in situ analyse af protein udtryk ved lysmikroskopi er et kraftfuldt værktøj til både forskning og diagnostiske formål. Men, visualisering og kvantificering af flere antigener i en enkelt væv afsnit ved hjælp af konventionelle kromogent IHC er udfordrende. Multiplex imaging er især relevant i lymfom forskning og diagnosticering, hvor markører skal fortolkes i forbindelse med en kompleks tumor mikromiljø. Her beskriver vi en protokol for multipleksede fluorescerende IHC farvning for at aktivere den kvantitative vurdering af flere mål i specifikke celletyper interesse for lymfom. Metoden dækker aspekter af antistof validering, antistof optimering, multiplex optimering med markører af lymfom undertyper, farvning af væv microarray (TMA) dias, og scanning af dias, efterfulgt af dataanalyse med specifikke henvisning til lymfom. Brug denne metode, genereres noder for begge betyde intensiteten af en markør for interesse og procentdel positivitet for at lette yderligere kvantitative analyser. Multiplexing minimerer prøve udnyttelse og giver geografisk information for hver markør af interesse.

MF-IHC billeder til en DLBCL prøve med C-MYC og BCL2 gen omlejring (dobbelt-hit lymfom) er vist i figur 1. Figur 2 illustrerer den simulerede lysfelt immunhistokemiske billeder. Figur 3 viser generation af procentdel data. Figur 4 viser detaljerne for en median formel for generation af numeriske data. Figur 5 viser anvendelsen af mf-IHC af ...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma at JoVE.com

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Her beskriver vi en protokol for multiplex fluorescerende immunhistokemisk farvning og imaging for simultan lokalisering af flere kræft-associerede antigener i lymfom. Denne protokol kan udvides til en colocalization analyse af biomarkører inden for alle væv sektioner.

Multiplex fluorescerende immunhistokemisk farvning, billedbehandling og analyse i histologiske prøver af lymfom

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

Lymfomer er histologisk komplekse tumorer. Derfor, multiplexed fluorescerende immunohistokemi tilbyder fordele i forhold til konventionelle kromogene immunohistochemistry at studere markører af interesse i tumorceller og mikromiljø. Denne teknik har potentiale til at standardisere scoring af antistof baseret farvning i histologiske lymfom prøver, en proces, der historisk har været udfordrende på grund af kompleksiteten af tumor mikromiljø.Specifikt giver multiplexed fluorescerende immunohistokemi og spektral billeddannelse mulighed for kvantitativ måling af flere pletter inden for et enkelt dias, hvilket gør det muligt at vurdere antigen co ekspression og spacial forhold inden for klinisk materiale. Begynd med at nedsænke de devokserede og rehydrerede dias i en standardantigen hentningsbuffer i en mikrobølgeovnsspandeglas og udføre varmeinduceret epitopudtagning i en egnet mikrobølgeovn. Udfør yderligere runder af mikrobølgestrimning baseret på antistoffets position i den endelige multiplexsekvens.For eksempel kræver det fjerde antistof yderligere tre runder af mikrobølgestrimning før farvning. Når strippingprocessen er afsluttet, anvendes der scependler og varmesikre handsker til at overføre objektglassene til destilleret vand ved stuetemperatur i mindst 10 minutters nedkøling. Når antigenudtagningsopløsningen er afkølet, blokeres vævsperoxidaseaktiviteten med en kommerciel peroxidaseblok i 10 minutter efterfulgt af en fem minutters vask i tris-buffered saltvand eller TBS og et ikke-ionisk rengøringsmiddel.Sæm al ufølg farvning med en 10 minutters inkubation i blokerende buffer efterfulgt af inkubation med det primære antistof af interesse ved stuetemperatur i 30 minutter og tre fem minutters vask med TBS-D buffer. Derefter inkuberes prøverne med et passende peberrodsperoxidase, der er konjugeret sekundært antistof i 15 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af tre vaske i TBS-D-buffer som påvist. Efter den sidste vask påføres et passende tyramidbaseret fluorescerende reagens på objektglassene i en fem minutters inkubation ved stuetemperatur efterfulgt af tre fem minutters TBS-D-vask.Udfør en ekstra mikrobølgebaseret stripning for at fjerne de primære og sekundære antistoffer i frisk antigenhentningsopløsning som påvist. I slutningen af udtagningen af rutsjebanerne afkøles i destilleret vand, og områderne på objektglassene tørres uden væv med laboratorieservietter. Inkuber dias med dappy i 10 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af tre TBS-D vasker.Tør derefter forsigtigt objektglassene med laboratorieservietter uden at kontakte vævene og montere prøverne med et passende monteringsmedium til billedbehandling. Ved scanning af monopleksdias skal du vælge de relevante filtre fra de fluorofokrofoner, der anvendes til mærkning af prøverne, og undersøge hver markør og dens tilsvarende fluorescenskanal for at identificere en passende eksponeringstid for at opnå et rent signal med fokus på vævskomponenten, som skal have det stærkeste signal til markøren. Hvis du vil tillade sammenligning af pixelintensiteten på tværs af stikprøver, skal du bruge indstillingen for livekamera til at justere eksponeringstiden i hver enkelt kanal, indtil der ikke er overeksponerede områder i livekamerabilledet.Når alle dias er blevet scannet, erhverve simulerede lyse felt billeder til visuelt sammenligne med den normale immunhiskemiske mønster og for at afgøre, om farvning mønster er korrekt. For at scanne væv microarray dias, skal du bruge væv microarray scanning tilstand i billeddannelse system og en passende auto fokus algoritme. For hele væv sektion dias, har dias gennemgået af en kvalificeret patolog til at vælge optimale billeder fra de mest repræsentative tumor områder.Før du begynder analysen, skal du vælge en tumormarkør for at identificere de celler af interesse for analysen. Få en patolog til at gennemgå billederne og beslutte, om vævssegmentering er påkrævet. Hvis det er nødvendigt, skal du vælge de relevante kontrolområder til segmentering og kontrollere, om billedanalysesoftwaren kan identificere sådanne områder korrekt.Efter cellesegmenteringen skal patologen gennemgå segmenteringskortet for at sikre pålideligheden af den tilsigtede segmenteringsmetode og gennemgå individuelle billeder for at afgøre, om cellesegmenteringen er tilstrækkelig, eller om der kræves yderligere vævssegmentering for at vælge områder beriget til tumorceller, stroma og eller nekrose. Derefter bestemme den optiske intensitet positiv cutoff værdi for hver markør sammen med patolog og generere histogrammer i en passende statistik software program til at analysere frekvensfordelingen af markøren intensiteten pr celle. Hvis du vil generere procentdata for bestemte interessemærker i definerede celler, skal du indsætte en pivottabel i dataarket og vælge Sum for at beregne positivitetsprocenten for en enkelt interessemarkør.Det samlede antal markør positive celler divideret med det samlede antal vil blive beregnet. Resultatet er markør positiv celle procent med en kerne, eller en undersøgelse nummer. For at generere numeriske data skal du opnå gennemsnitsintensiteten for hver interessemarkør i alle cellerne i en prøve for at udtrække det median normaliserede antal for hver markør for hver kerne eller studienummer.Her vises repræsentative multixlysorescerende immunohistokemiske billeder til en diffus stor B-celle lymfomprøve med c-MYC og BCL2 genomlægning. Simulerede lyse felt immunohistochemical billeder viser en lignende tumor markør farvning mønster. Anvendelsen af multix fluorescerende immunohistokemiske billeder til en T-celle panel i angioimmunoblastic T-celle lymfomer afslører celle heterogenitet af tumorprøven.Her vises optimering af en tonsilkontrolprøve og den resulterende dataanalyse. En række billedanalyse softwareprogrammer kan bruges efter ublandet skridt til at kvantere markør udtryk og lokalisering i tumorceller og tumor mikromiljø. Denne teknik baner vejen for forskere at studere co ekspression af flere markører inden for specifikke celletyper i enkelt væv dele af lymfom.Sørg for at undgå varmeinduceret skade under mikrovæddetrinene, og vær opmærksom på faldrisici under de scanningstrin, der udføres i dækket.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Multiplex Påvisning af Bakterier i komplekse kliniske og miljøprøver hjælp Oligonucleotid koblede Fluorescent Mikrokugler

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Ikke-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Fluorescens optisk billeddannelse af inflammatorisk MMP Aktivitet Brug et aktiverbart Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Meget multiplexeret, superopløselig billeddannelse af T-celler ved hjælp af madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Anvendelse af kapsler til negativ farvning af virale prøver inden for biokonduktion

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

Histologiske kvantificering at bestemme lunge svampe byrde i eksperimentel aspergillose

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

Ved hjælp af robotsystemer til at behandle og integrere Colon Murine prøver for histologiske analyser

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Øget rabies overvågning ved hjælp af en direkte, hurtig immun Histokemisk test

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...