Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma at JoVE.com

S.-B.N. en A.D.J. worden ondersteund door de Singapore ministerie van volksgezondheid nationale medische onderzoek Raad overgang Awards (NMRC/TA/0020/2013 en NMRC/TA/0052/2016). De auteurs erkennen een onderzoeksbeurs van Yong Siew Yoon aan A.D.J. van de nationale universiteit kanker instituut van Singapore naar de aankoop van een Vectra spectrale imaging Microscoop. Deze studie is goedgekeurd door de Singapore NHG domein specifieke Review Board B (2014/00693).

Alle weefsels in dit protocol gebruikt werden verkregen onder de Singapore NHG domein specifieke Review Board B 2014/00693 studie.
1. selectie en validatie van antilichamen
Opmerking: Voordat u verdergaat met de instelling van een multiplexed panel, zorgen dat alle antilichamen vlek krachtig, identificeren van alleen de doel-antigeen van belang. Het doel is het selecteren van antilichamen die specifiek het antigeen van belang in weefselsecties wordt herkend.
<ol><...

<ol>
	<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+revision+of+the+World+Health+Organization+classification+of+lymphoid+neoplasms.">The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms.</a> Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).</li><li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).</li><li>Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+for+Pathologists:+Protocols,+Pitfalls,+and+Tips.">Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+profiling+of+lymphoma.">Immunohistochemical profiling of lymphoma.</a> Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).</li><li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues.">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li><li>Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+Quantitative+Analysis+of+Protein+Expression.">Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Visualization+of+Multiple+Antigens+with+Tyramide+Signal+Amplification+using+Antibodies+from+the+same+Species.">Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Ng, S. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+a+Multiplexed+Immunofluorescence+Panel+in+T-Cell+Lymphoma.">Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma.</a> SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).</li><li>Bogusz, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+large+B-cell+lymphoma+with+concurrent+high+MYC+and+BCL2+expression+shows+evidence+of+active+B-cell+receptor+signaling+by+quantitative+immunofluorescence.">Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).</li><li>Kalyuzhny, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).</li><li>Bordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+validation.">Antibody validation.</a> BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual. , (2012).</li><li>Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+beyond+P+values:+Everyday+data+analysis+with+estimation+plots.">Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+Imaging+of+T+and+B+Cells+in+Murine+Spleen+and+Tumor.">Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor.</a> The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).</li></ol>

MF-IHC heeft het potentieel om pathologen verfijnen diagnosticcriteria lymfoïde pathologie en analyseren van de rol van biomarkers in specifieke celtypen richting een voorspelling van klinische resultaten. Als een nieuwe onderzoeksmethode, wordt mf-IHC steeds meer toegepast op de kwantitatieve en ruimtelijke identificatie van meerdere immuun parameters van tumor cellen17. De detectie van mf-IHC voor de co expressie van tumor biomarkers gebleken reproduceerbaar zijn en betrouwbare<sup class="xref"...

Lymfoïde gezwellen worden veroorzaakt door de ongecontroleerde kwaadaardige proliferatie van lymfocyten. Deze cellen zijn essentiële componenten van het immuunsysteem en lokaliseren naar de primaire en secundaire immuun organen, zoals het beenmerg, lymfeklieren, milt en andere mucosa-geassocieerde lymfoïde systeem. Lymfoïde gezwellen zijn een heterogene groep van stoornissen die worden geclassificeerd gebaseerd op een constellatie van functies, waaronder morfologie, immunophenotype, genetische kenmerken, en klinische presentatie. Terwijl elke parameter een rol speelt, afkomst blijft een kenmerkend en vormt de basis voor de WHO classificatiesysteem die gezwellen afgeleid van natural killer (NK) cellen1, B-cellen en T-cellen herkent.
Sleutel tot de classificatie van lymfoom is de karakterisatie van de antilichamen tegen leukocyten oppervlakte merkers van de verschillende subtypen van lymfocyten2. Immunohistochemistry (IHC) heeft van oudsher wordt gebruikt voor de analyse van deze markers en is gebaseerd op het beginsel van de erkenning van de specifieke antigeen-antilichaam aan de cel - en weefsel-gebaseerde moleculen die kunnen worden gevisualiseerd door de lichte Microscoop detecteren 3. de identificatie van meerdere doelen voor een enkele dia door conventionele helder-veld chromogenic multiplex IHC heeft echter beperkingen omdat het vaak moeilijk te onderscheiden van meerdere signalen van de kleur op een enkele weefselsectie betrouwbaar — met name voor antigenen met een zeer lage expressie4. Visuele beoordeling en kwantificering van kleuring kunnen ook subjectief, variabiliteit veroorzaakt in de analyse en data interpretatie5.
Conventionele IHC op monsters van formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) dus niet haalbaar voor de simultane detectie van meerdere doelen in via het immuunsysteem veroorzaakte uiteenlopende ziekten zoals lymfoom. Bovendien is het vaak onnauwkeurig neoplastische lymfocyten van de omliggende immuuncellen onderscheid te maken. Dit belemmert de studies te kijken naar de relevantie van nieuwe biomarkers in lymfoom. In dit verband, multiplex fluorescerende IHC (mf-IHC) biedt een veelbelovend alternatief als hierdoor de kwantitatieve beoordeling van antigeen coexpression en een ruimtelijke relatie met hogere precisie terwijl het behoud van de beperkte monsters6,7. Wanneer deze imaging technologie is een partnerschap aangegaan met de software van de analyse van de digitale beelden, de data interpretatie bestaat efficiënter en vergemakkelijkt de studie van de tumor en communicatie heterogeniteit8,9. In dit protocol, een tyramide gebaseerde immunofluorescentie (IF) Multiplex methode wordt toegepast op het signaal versterken en is compatibel met elke IHC-gevalideerde antilichaam van elke soort die host, zelfs die zijn ontwikkeld in de dezelfde soort5,7 , 10. de tyramide-gebaseerd protocol voorziet in de directe Woordherkomst en-opbouw van de fluorophore aan het weefsel van belang zodat de primaire en secundaire antilichaam kan worden gestript na elke stap, waardoor de sequentiële toepassing van meerdere vlekken zonder antilichaam Kruisallergie.
Een multiplexed strategie zal zitten nuttig voor het voorspellen van de resultaten van de prognose en behandeling door het identificeren van doelstellingen en hun variant immunologische patronen in lymfomen. Multiplex TL IHC is toegepast in ons lab voor de studie van een panel van T en B-lymfocyt markers en T-folliculaire helper markeringen in angioimmunoblastic T-cel lymfoom (AITL), een subtype van een perifere T-cel lymfoom gekenmerkt door agressieve klinische gedrag en tumor heterogeniteit11. Het nut van deze methode wordt ook geïllustreerd in diffuus grote B-cel lymfoom (DLBCL) waar de toegenomen signalering van een B-cel receptor met gelijktijdige C-MYC en BCL-2 uitdrukking het potentiële therapeutische gebruik van Bruton van tyrosine kinase remming suggereert 12 . 
Hier beschrijven we het gehele protocol van antilichaam validatie bij de selectie van passende controlemaatregelen weefsels en multiplex met behulp van lymfoom FFPE weefsels, met een eventuele analyse van gebeitst dia's met behulp van een standaardscanoptie geautomatiseerde kwantitatieve pathologie imaging systeem.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>REF S3022</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>For peroxide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra multispectral automated microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Vectra2.0.8</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1135</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF822001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF812001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL6</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-MYC</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy 5</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1171</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>Graph pad</td>
			<td></td>
			<td>Statisitcal software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoClear Clearing Agent</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H2779-1L</td>
			<td>Histoclear for dewaxing and clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced 
			Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Inform Software 2.2.1</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI67</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOS MILESTONE multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone</td>
			<td></td>
			<td>Microwave for Heat induced epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>PANASONIC</td>
			<td>NN-ST651M</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>81381 Aldrich Mowiol&#174; 4-88</td>
			<td>mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1488</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal520</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1487B21</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal540</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1494</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal620</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1495</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for tissue section adhesion in routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2367</td>
			<td>For HIER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer saline (TBS)</td>
			<td>1st BASE</td>
			<td>BUF3030 20X4L</td>
			<td>for buffer wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td>Tween</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma

Immunohistochemische (IHC) methoden voor de analyse van de in-situ van eiwit expressie door de lichte microscopie is een krachtig hulpmiddel voor zowel onderzoek en diagnostische doeleinden. Echter is de visualisatie en de kwantificering van meerdere antigenen in een enkele weefselsectie met behulp van conventionele chromogenic IHC uitdagend. Multiplexed imaging is vooral relevant in lymfoom onderzoek en diagnostiek, waar markeringen moeten worden geïnterpreteerd in de context van een complexe tumor communicatie. Hier beschrijven we een protocol voor multiplexed fluorescerende IHC kleuring zodat de kwantitatieve beoordeling van meerdere doelen in specifieke celtypen belangstelling lymfoom. De methode omvat aspecten van validatie van antilichaam, antilichaam optimalisatie, de multiplex optimalisatie met markeringen van lymfoom subtypen, de kleuring van weefsel microarray (TMA) dia's en het scannen van dia's, gevolgd door data-analyse, met specifieke verwijzing naar lymfoom. Met behulp van deze methode, worden scores voor zowel het gemiddelde intensiteit van een marker van belang en het percentage positiviteit gegenereerd om verdere kwantitatieve analyse. Multiplexing minimaliseert monster benutting en ruimtelijke informatie voor iedere markeerdraad van belang.

MF-IHC beelden voor een DLBCL monster met C-MYC en BCL2 gen omlegging (dubbel-hit lymfoom) worden weergegeven in Figuur 1. Figuur 2 illustreert de gesimuleerde helder-veld immunohistochemische beelden. Figuur 3 geeft de generatie van percentage gegevens. Figuur 4 geeft de details van een mediane formule voor de generatie van numerieke gegevens. Figuu...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma at JoVE.com

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Hier beschrijven we een protocol voor multiplex fluorescerende immunohistochemische kleuring en imaging voor de gelijktijdige localisatie van meerdere kanker-geassocieerde antigenen in lymfoom. Dit protocol kan worden uitgebreid tot de colocalization analyse van biomarkers binnen alle weefselsecties.

Multiplexed fluorescerende immunohistochemische kleuring, Imaging en analyse in histologische monsters van lymfoom

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

Lymfoom zijn histologisch complexe tumoren. Daarom biedt multiplexed fluorescerende immunohistochemie voordelen ten opzichte van conventionele chromogene immunohistochemie om markers van belang in de tumorcellen en de micro-omgeving te bestuderen. Deze techniek heeft het potentieel voor het standaardiseren van het scoren van antilichaam gebaseerde kleuring in histologische lymfoommonsters, een proces dat historisch gezien uitdagend is geweest vanwege de complexiteit van de tumormicro-omgeving.Met name multiplexed fluorescerende immunohistochemie en spectrale beeldvorming maken het mogelijk om meerdere vlekken binnen één dia kwantitatief te meten, waardoor de beoordeling van antigeenco expressie en ruimtelijke relatie binnen klinisch materiaal mogelijk is. Begin met het onderdompelen van de ontwaxte en gehydrateerde glijbanen in een standaard antigeen retrieval buffer in een magnetron op te slaan glazen pot en het uitvoeren van warmte-geïnduceerde epitoop ophalen in een geschikte magnetron. Voer extra rondes van microgolf strippen op basis van de positie van het antilichaam in de laatste multiplex sequentie.Bijvoorbeeld, het vierde antilichaam vereist drie extra rondes van de magnetron strippen voorafgaand aan vlekken. Gebruik na voltooiing van het stripproces tangen en hittebestendige handschoenen om de glijbanen bij kamertemperatuur gedurende een afkoeling van ten minste 10 minuten over te brengen op gedestilleerd water. Wanneer de antigeen retrieval oplossing is afgekoeld, blok de weefselperoxidase activiteit met een commerciële peroxidase blok gedurende 10 minuten, gevolgd door een vijf minuten wassen in tris-gebufferde zoutoplossing, of TBS, en een niet-ionisch wasmiddel.Blokkeer elke niet-specifieke kleuring met een incubatie van 10 minuten bij het blokkeren van buffer, gevolgd door incubatie met het primaire antilichaam van belang bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten en drie vijf minuten wasbeurten met TBS-D buffer. Vervolgens, incubeer de monsters met een geschikte mierikswortel peroxidase geconjugeerde secundaire antilichaam gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door drie wasbeurten in tbs-D buffer zoals aangetoond. Breng na de laatste wasbeurt een passend fluorescerend reagens op basis van tyramide aan op de dia's voor een incubatie van vijf minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door drie tbs-d-d-wasbeurten van vijf minuten.Voer een extra microgolf gebaseerd strippen om de primaire en secundaire antilichamen te verwijderen in verse antigeen retrieval oplossing zoals aangetoond. Aan het einde van het ophalen, koel de glijbanen in gedestilleerd water en droog de gebieden op de dia's zonder weefsel met lab doekjes. Incubeer glijbaan met dappy voor 10 minuten op kamertemperatuur, gevolgd door drie TBS-D wasbeurten.Droog vervolgens de dia's zorgvuldig met labdoekjes zonder contact op te nemen met de weefsels en monteer de monsters met een geschikt montagemedium voor beeldvorming. Voor monoplexdiascanning selecteert u de juiste filters uit de fluorofoforen die worden gebruikt voor het labelen van de monsters en onderzoekt u elke markering en het bijbehorende fluorescentiekanaal om een geschikte belichtingstijd te identificeren voor het verkrijgen van een schoon signaal, waarbij de nadruk ligt op de weefselcomponent die het sterkste signaal voor de markering zou moeten hebben. Als u een vergelijking van de pixelintensiteit wilt toestaan, gebruikt u de live camera-instelling om de belichtingstijd in elk afzonderlijk kanaal aan te passen totdat er geen overbelichte gebieden in het live camerabeeld zijn.Wanneer alle dia's zijn gescand, verwerven gesimuleerde heldere veldbeelden visueel te vergelijken met de normale immunohistochemische patroon en om te bepalen of de kleuring patroon juist is. Om weefselmicroarraydia's te scannen, gebruikt u de tissuemicroarray-scanmodus in het beeldvormingssysteem en een geschikt autofocusalgoritme. Voor hele weefsel sectie dia's, hebben de dia's beoordeeld door een gekwalificeerde patholoog om optimale beelden te selecteren uit de meest representatieve tumor gebieden.Voordat u met de analyse begint, selecteert u een tumormarker om de cellen van belang voor de analyse te identificeren. Laat een patholoog de beelden bekijken en beslissen of weefselsegmentatie nodig is. Selecteer indien nodig de juiste controlegebieden voor segmentatie en controleer of de software voor beeldanalyse dergelijke regio's correct kan identificeren.Laat de patholoog na de celsegmentatie de segmentatiekaart bekijken om de getrouwheid van de beoogde segmentatiebenadering te garanderen en afzonderlijke afbeeldingen te bekijken om te bepalen of de celsegmentatie toereikend is of dat extra weefselsegmentatie nodig is om gebieden te selecteren die zijn verrijkt voor tumorcellen, stroma en of necrose. Bepaal vervolgens de optische intensiteit positieve cutoff waarde voor elke marker in combinatie met de patholoog en het genereren van histogrammen in een geschikte statistische software programma om de frequentie verdeling van de marker intensiteit per cel te analyseren. Als u percentagegegevens wilt genereren voor specifieke markeringen van belang binnen gedefinieerde cellen, voegt u een draaitabel in het gegevensblad in en selecteert u Som om het positiviteitspercentage van één markering van belang te berekenen.Het totale aantal positieve markercellen gedeeld door het totale aantal wordt berekend. Het resultaat is het markerpositief celpercentage met één kern of één studienummer. Als u numerieke gegevens wilt genereren, krijgt u de gemiddelde intensiteit van elke markering van belang in alle cellenstudie binnen een monster om de genormaliseerde telling van de mediaan voor elke markering van elke kern of studienummer te extraheren.Hier worden representatieve multiplex fluorescerende immunohistochemische beelden getoond voor een diffuus groot B-cel lymfoommonster met c-MYC en BCL2-gen herschikt. Gesimuleerde heldere veld immunohistochemische beelden tonen een soortgelijke tumor marker kleuring patroon. De toepassing van multiplex fluorescerende immunohistochemische beelden op een T-cel paneel in angio-immunooblastische T-cel lymfoom onthult de cel heterogeniteit van het tumormonster.Hier worden de optimalisatie van een tonsillencontrolemonster en de resulterende data-analyse getoond. Een verscheidenheid van beeldanalyse software programma's kunnen worden gebruikt na de unmixing stap naar marker expressie en lokalisatie in tumorcellen en de tumor micro-omgeving quantitate. Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers om de co-expressie van meerdere markers binnen specifieke celtypen in afzonderlijke weefselssecties van lymfoom te bestuderen.Zorg ervoor dat u tijdens de microwaving-stappen door hitte wordt veroorzaakt en wees u bewust van de valrisico's tijdens de scanstappen die in het dek worden uitgevoerd.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Afleiding van thymus lymfoom T-cel-Lines uit Atm - / -</sup En P53 - / -</sup Muizen

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Het gebruik van TL-Immuno-Chemie voor de detectie van Edwardsiella ictaluri In kanaal meerval ( I. punctatus) Monsters

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Niet-invasieve<em&gt; In Vivo</em&gt; Fluorescentie Optische Imaging van Inflammatorische MMP Activiteit Met behulp van een Activateerbare Fluorescerende Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Zeer Multiplexed, Superresolutie Imaging van T-cellen Met behulp van madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Gebruik van capsules voor negatief vlekken van virale monsters in biocontainment

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

Histologische kwantificering te bepalen van de schimmel last long in experimentele aspergillose

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

Met behulp van Robotic systemen te verwerken en Embed Colon lymfkliertest monsters voor histologisch Analyses

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Verbeterde bewaking van rabiës met behulp van een directe snelle immunohistochemische test

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...