Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00
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S.-B.N. et A.D.J. sont pris en charge par nationale médicale recherche Conseil Transition Awards le Singapour ministère de la santé (NMRC/TA/0020/2013 et NMRC/TA/0052/2016). Les auteurs reconnaissent une subvention de recherche de Yoon Yong Siew à A.D.J. de l’Université nationale du Cancer Institut de Singapour pour l’achat d’un microscope d’imagerie spectral de Vectra. Cette étude est approuvée par le Singapore NHG domaine spécifique Review Board B (2014/00693).

Tous les tissus utilisés dans le présent protocole ont été obtenus sous la Singapour NHG domaine spécifique Review Board B étudier 2014/00693.
1. sélection et Validation des anticorps
Remarque : Avant de procéder à la mise en place d’un panneau de multiplex, assurez-vous que tous les anticorps tachent robuste, identifiant uniquement l’antigène cible d’intérêt. Le but est de sélectionner des anticorps qui reconnaissent spécifiquement l’antigène ...

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MF-IHC a le potentiel pour permettre des pathologistes d’affiner diagnosticcriteria en pathologie lymphoïde et d’analyser le rôle des biomarqueurs dans les types spécifiques de cellules vers une prévision des résultats cliniques. Comme une nouvelle méthode de recherche, mf-IHC est plus appliquée à la détermination quantitative et spatiale des multiples paramètres immunitaires des cellules de tumeur17. La détection de mf-IHC pour la co-expression de biomarqueurs de la tumeur s’est ...

Les tumeurs lymphoïdes sont causés par la prolifération maligne anarchique des lymphocytes. Ces cellules sont des composantes essentielles du système immunitaire et localiser les organes immunitaires primaires et secondaires, tels que la moelle osseuse, ganglions lymphatiques, la rate et autre système lymphoïde associé aux muqueuses. Les tumeurs lymphoïdes sont un groupe hétérogène d’affections qui sont classées basé sur une constellation de caractéristiques, dont la morphologie lymphoblastiques, les caractéristiques génétiques et présentation clinique. Tandis que chaque paramètre joue un rôle, lignée reste une caractéristique déterminante et constitue la base pour le système de classification OMS qui reconnaît les néoplasmes dérivés de cellules B et les lymphocytes T natural killer (NK) cellules1.
Clé à la classification du lymphome est la caractérisation des anticorps contre les marqueurs de surface de leucocytes des différents sous-types de lymphocytes2. L’immunohistochimie (IHC) a été utilisé traditionnellement pour l’analyse de ces marqueurs et repose sur le principe de la reconnaissance de l’antigène-anticorps spécifique pour détecter des molécules axée sur les cellules et les tissus qui peuvent être visualisées par le microscope photonique 3. Toutefois, l’identification de cibles multiples sur une seule diapositive, par conventionnel lumineux-zone chromogène multiplex IHC a des limites car il est souvent difficile de distinguer de multiples signaux de couleur sur une section de tissu unique fiable — surtout pour les antigènes avec une expression très faible4. Évaluation visuelle et la quantification de coloration peuvent aussi être subjectives, provoquant la variabilité dans l’analyse et les données interprétation5.
IHC classique sur des échantillons (FFIP) fixés au formol, paraffine n’est donc pas possible pour la détection simultanée de multiples cibles immunologiquement diverses maladies comme le lymphome. En outre, la distinction lymphocytes néoplasiques des cellules immunitaires environnantes est souvent imprécise. Cela empêche les études examinant la pertinence de nouveaux biomarqueurs dans le lymphome. Dans ce contexte, multiplexe fluorescent IHC (mf-IHC) offre une alternative prometteuse, car il permet l’évaluation quantitative de la coexpression de l’antigène et une relation spatiale avec une plus grande précision tout en conservant un limité d’échantillons6,7. Lorsque cette technologie d’imagerie est en partenariat avec le logiciel d’analyse de l’image numérique, l’interprétation des données est rendue plus efficace et facilite l’étude de la tumeur et microenvironnement hétérogénéité8,9. Dans ce protocole, une base tyramide immunofluorescence (IF) méthode de multiplexage est appliquée pour amplifier le signal et est compatible avec n’importe quel anticorps IHC-validé de toute espèce d’hôte, même ceux mis au point à la même espèce5,7 , 10. le protocole tyramide permet la conjugaison directe du fluorophore au tissu d’intérêt pour que les anticorps primaires et secondaires peuvent être dépouillés après chaque étape, permettant l’application séquentielle de plusieurs taches sans la réactivité des anticorps.
Une stratégie multiplexée sera utile pour prédire le pronostic et le traitement des résultats par l’identification des cibles et leurs profils immunologiques variant dans les lymphomes. Multiplexe fluorescent IHC a été appliquée dans notre laboratoire pour l’étude d’un panel de marqueurs T et les lymphocytes B et T-folliculaire d’assistance dans le lymphome de T-cellule d’angioimmunoblastic (AITL), un sous-type d’un lymphome à cellules T périphérique caractérisée par agressivité clinique comportement et tumeur hétérogénéité11. L’utilité de cette méthode est également illustrée en diffus grand lymphome B (LMNH) où la signalisation accrue d’un récepteur des cellules B avec l’expression simultanée de C-MYC et BCL-2 suggère l’utilisation thérapeutique potentielle d’inhibition de la tyrosine kinase de Bruton 12 . 
Nous décrivons ici l’ensemble du protocole de validation de l’anticorps à la sélection des tissus appropriés de contrôle et de multiplexage à l’aide de lymphome FFIP tissus, avec une éventuelle analyse de lames colorées en utilisant un balayage automatisé d’imagerie quantitative pathologie système.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>REF S3022</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>For peroxide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra multispectral automated microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Vectra2.0.8</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1135</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF822001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF812001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL6</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-MYC</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy 5</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1171</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>Graph pad</td>
			<td></td>
			<td>Statisitcal software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoClear Clearing Agent</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H2779-1L</td>
			<td>Histoclear for dewaxing and clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced 
			Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Inform Software 2.2.1</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI67</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOS MILESTONE multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone</td>
			<td></td>
			<td>Microwave for Heat induced epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>PANASONIC</td>
			<td>NN-ST651M</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>81381 Aldrich Mowiol&#174; 4-88</td>
			<td>mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1488</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal520</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1487B21</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal540</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1494</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal620</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1495</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for tissue section adhesion in routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2367</td>
			<td>For HIER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer saline (TBS)</td>
			<td>1st BASE</td>
			<td>BUF3030 20X4L</td>
			<td>for buffer wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td>Tween</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma

Immunohistochimie (IHC) méthodes pour l’analyse in situ d’expression de la protéine au microscope photonique sont un outil puissant pour la recherche et des fins de diagnostic. Cependant, la visualisation et la quantification des antigènes multiples dans une section de tissu unique aide IHC chromogène conventionnel est difficile. L’imagerie multiplexé est particulièrement pertinent dans la recherche de lymphome et de diagnostics, où les marqueurs devront être interprétées dans le contexte d’un micro-environnement tumoral complexe. Nous décrivons ici un protocole pour multiplexé IHC fluorescent coloration afin de permettre l’évaluation quantitative de cibles multiples dans les types spécifiques de cellules d’intérêt dans le lymphome. La méthode couvre les aspects de validation de l’anticorps, l’optimisation de l’anticorps, l’optimisation multiplexe avec des marqueurs des sous-types de lymphomes, la coloration des lames de tissu microarray (TMA) et la numérisation des diapositives, suivie d’analyse de données, avec spécifiques référence de lymphome. En utilisant cette méthode, partitions pour les deux l’intensité moyenne d’un marqueur d’intérêt et la pourcentage de positivité sont générées afin de faciliter la poursuite des analyses quantitatives. Multiplexage minimise l’utilisation de l’échantillon et fournit de l’information spatiale pour chaque marqueur d’intérêt.

MF-IHC image pour un échantillon de LMNH avec C-MYC et réarrangement génique de BCL2 (double-hit lymphome) sont affichées à la Figure 1. La figure 2 illustre les images simulées lumineux-zone immunohistochimique. La figure 3 indique la génération des données de pourcentage. La figure 4 affiche les détails d’une formule médiane pour la génération de donnée...

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Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Nous décrivons ici un protocole pour multiplex immunohistochemical fluorescent de coloration et d’imagerie pour la localisation simultanée de plusieurs antigènes associés aux cancer des lymphomes. Ce protocole peut être étendu à l’analyse de colocalisation de biomarqueurs dans toutes les coupes de tissus.

Marquage immunohistochimique Fluorescent multiplexé, l’imagerie et l’analyse des échantillons histologique du lymphome

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

Les lymphomes sont des tumeurs histologiquement complexes. Par conséquent, l’immunohistochimie fluorescente multiplexe offre des avantages par rapport à l’immunohistochimie chromogène conventionnelle pour étudier les marqueurs d’intérêt dans les cellules tumorales et le microenvironnement. Cette technique a le potentiel de normaliser la notation de la coloration basée sur l’anticorps dans les échantillons histologiques de lymphome, un processus qui a toujours été difficile en raison de la complexité du microenvironnement de tumeur.Plus précisément, l’immunohistochimie fluorescente multiplexe et l’imagerie spectrale permettent la mesure quantitative de taches multiples dans une seule diapositive, permettant ainsi l’évaluation de l’expression de co d’antigène et de la relation spaciale dans le matériel clinique. Commencez par immerger les glissières désespérées et réhydratées dans un tampon de récupération d’antigène standard dans un bocal en verre économisez au micro-ondes et effectuez la récupération d’épitope induite par la chaleur dans un four à micro-ondes approprié. Effectuez des séries supplémentaires de décapage micro-ondes en fonction de la position de l’anticorps dans la séquence finale du multiplexe.Par exemple, le quatrième anticorps nécessite trois tours supplémentaires de décapage au micro-ondes avant de tacher. Après avoir terminé le processus de décapage, utilisez des forceps et des gants anti-chaleur pour transférer les glissières dans de l’eau distillée à température ambiante pendant au moins 10 minutes de refroidissement. Lorsque la solution de récupération de l’antigène s’est refroidie, bloquer l’activité des peroxydées tissulaires avec un bloc commercial de peroxydase pendant 10 minutes, suivi d’un lavage de cinq minutes en solution saline à trois tampons, ou SCT, et d’un détergent non ionique.Bloquez toute coloration non spécifique avec une incubation de 10 minutes dans le tampon de blocage suivie de l’incubation avec l’anticorps primaire d’intérêt à température ambiante pendant 30 minutes et trois lavages de cinq minutes avec tampon TBS-D. Ensuite, incubez les échantillons avec un peroxyde de raifort approprié conjugué anticorps secondaire pendant 15 minutes à température ambiante, suivie de trois lavages dans tbs-D tampon comme démontré. Après le dernier lavage, appliquez un réaccès fluorescent approprié à base de tyramide sur les glissières pendant une incubation de cinq minutes à température ambiante, suivi de trois lavages TBS-D de cinq minutes.Effectuez un décapage supplémentaire à base de micro-ondes pour éliminer les anticorps primaires et secondaires dans la solution de récupération d’antigène frais comme démontré. À la fin de la récupération, refroidir les glissières dans de l’eau distillée et sécher les zones sur les toboggans sans tissu avec des lingettes de laboratoire. Incuber la toboggan avec du dappy pendant 10 minutes à température ambiante, suivi de trois lavages TBS-D.Ensuite, séchez soigneusement les glissières avec des lingettes de laboratoire sans entrer en contact avec les tissus et montez les échantillons avec un support de montage approprié pour l’imagerie. Pour la numérisation des diapositives monoplexes, sélectionnez les filtres appropriés parmi les fluorophores utilisés pour étiqueter les échantillons et examinez chaque marqueur et son canal de fluorescence correspondant afin d’identifier un temps d’exposition approprié pour l’obtention d’un signal propre, en mettant l’accent sur le composant tissulaire qui devrait avoir le signal le plus fort pour le marqueur. Pour permettre une comparaison croisée de l’intensité du pixel, utilisez le réglage de la caméra en direct pour ajuster le temps d’exposition dans chaque canal individuel jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de zones surexposées dans l’image de la caméra en direct.Lorsque toutes les diapositives ont été numérisées, acquérir des images simulées de champ lumineux pour comparer visuellement avec le modèle immunohistochimique normal et pour déterminer si le modèle de coloration est correct. Pour numériser les diapositives de microrése tissulaire, utilisez le mode de balayage du microrése tissulaire dans le système d’imagerie et un algorithme de mise au point automatique approprié. Pour les diapositives entières de section de tissu, faites examiner les glissières par un pathologiste qualifié pour sélectionner des images optimales des secteurs les plus représentatifs de tumeur.Avant de commencer l’analyse, sélectionnez un marqueur tumoral pour identifier les cellules d’intérêt pour l’analyse. Demander à un pathologiste d’examiner les images et de décider si la segmentation des tissus est nécessaire. Si nécessaire, sélectionnez les régions de contrôle appropriées pour la segmentation et vérifiez si le logiciel d’analyse d’image peut identifier correctement ces régions.Après la segmentation cellulaire, demander au pathologiste d’examiner la carte de segmentation afin d’assurer la fidélité de l’approche de segmentation prévue et d’examiner les images individuelles afin de déterminer si la segmentation cellulaire est adéquate ou si une segmentation supplémentaire des tissus est nécessaire pour sélectionner les régions enrichies pour les cellules tumorales, le stroma et la nécrose. Déterminez ensuite la valeur de coupure positive de l’intensité optique pour chaque marqueur en collaboration avec le pathologiste et générez des histogrammes dans un logiciel statistique approprié pour analyser la distribution des fréquences de l’intensité du marqueur par cellule. Pour générer des données en pourcentage pour des marqueurs d’intérêt spécifiques dans les cellules définies, insérez une table pivotante dans la fiche de données et sélectionnez Sum pour calculer le pourcentage de positivité d’un seul marqueur d’intérêt.Le nombre total de cellules positives marqueurs divisées par le nombre total sera calculé. Le résultat est le pourcentage de cellules positives marqueur avec un noyau, ou un numéro d’étude. Pour générer des données numériques, obtenez l’intensité moyenne de chaque marqueur d’intérêt dans toutes les cellules étudiées au sein d’un échantillon afin d’extraire le nombre normalisé médian pour chaque marqueur de chaque noyau ou numéro d’étude.Ici, des images immunohistochimiques fluorescentes multiples représentatives pour un grand échantillon diffus de lymphome de B-cellule avec le réarrangement de gène de C-MYC et de BCL2 sont montrées. Les images immunohistochimiques simulées de champ lumineux démontrent un modèle semblable de coloration de marqueur de tumeur. L’application d’images immunohistochimiques fluorescentes multiplexes à un panneau de cellule T dans les lymphomes angioimmunoblastic de T-cellule indique l’hétérogénéité cellulaire de l’échantillon de tumeur.Ici, l’optimisation d’un échantillon de contrôle des amygdales et l’analyse des données qui en résulte sont affichées. Une variété de logiciels d’analyse d’image peuvent être utilisés après l’étape de désintoxication pour quantifier l’expression des marqueurs et la localisation dans les cellules tumorales et le microenvironnement tumoral. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour étudier la co-expression de marqueurs multiples dans des types de cellules spécifiques dans des sections de tissus simples du lymphome.Prenez soin de prévenir les blessures causées par la chaleur pendant les étapes de micro-ondes et soyez conscient des risques de chute pendant les étapes de balayage qui sont effectuées dans le pont.

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