Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00
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S.-B.N und A.D.J. werden von Singapur Gesundheitsministeriums medizinische Forschung Rat Übergang Staatspreise (NMRC/TA/0020/2013 und NMRC/TA/0052/2016) unterstützt. Die Autoren erkennen ein Forschungsstipendium Yong Siew Yoon, A.D.J. von der National University Cancer Institut von Singapore in Richtung zum Kauf von einem Vectra spectral imaging Mikroskop. Diese Studie ist von Singapur NHG Domäne bestimmte Review Board B zugelassen (2014/00693).

Alle Gewebe, die in diesem Protokoll verwendeten erhielten unter dem Singapur NHG Domain spezifische Review Board B 2014/00693 zu studieren.
1. Auswahl und Validierung von Antikörpern
Hinweis: Bevor Sie mit der Einsetzung einer Multiplex, sicherstellen Sie, dass alle Antikörper robust, Färben nur das Ziel-Antigen des Interesses zu identifizieren. Ziel ist es, Antikörper, die spezifisch das Antigen des Interesses an Gewebeschnitten erkennen, wählen.
<ol><li>Be...

<ol>
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MF-IHC hat das Potenzial, Pathologen, Diagnosticcriteria in lymphatischen Pathologie zu verfeinern und Analyse die Rolle von Biomarkern in bestimmten Zelltypen in Richtung einer Vorhersage des klinischen Ergebnisses ermöglichen. Als eine neue Forschungsmethode ist mf IHC zunehmend auf die quantitative und räumliche Identifizierung von mehreren Immunparameter Tumor Zellen17angewendet. Die Erkennung von mf-IHC Co Ausdruck der Tumor Biomarker hat sich gezeigt, reproduzierbare und zuverlässige<sup ...

Lymphoide Neubildungen entstehen durch das unkontrollierte maligne Proliferation von Lymphozyten. Diese Zellen sind wichtige Komponenten des Immunsystems und die primäre und sekundäre immun Organe wie Knochenmark, Lymphknoten, Milz und anderen Mukosa-assoziierten lymphatischen System zu lokalisieren. Lymphatischen Tumoren bilden eine heterogene Gruppe von Erkrankungen, die eingestuft werden, basierend auf einer Konstellation von Features, einschließlich Morphologie, Immunophenotype, genetischen Eigenschaften und klinische Präsentation. Während jeder Parameter eine Rolle spielt, bleibt ein bezeichnendes Merkmal Abstammung und bildet die Grundlage für das Klassifikationssystem der WHO, das Neubildungen abgeleitet von B-Zellen, T-Zellen und natürlichen killer (NK) Zellen1erkennt.
Entscheidend für die Einstufung des Lymphoms ist die Charakterisierung von Antikörpern gegen Leukozyten Oberflächenmarker der verschiedenen Untertypen von Lymphozyten2gewesen. Immunhistochemie (IHC) ist traditionell für die Analyse solcher Marker benutzt worden und basiert auf dem Prinzip der spezifischen Antigen-Antikörper-Anerkennung, Zell- und gewebebasierten Moleküle erkennen, die durch das Lichtmikroskop visualisiert werden können 3. die Identifizierung von mehreren Zielen auf eine einzelne Folie durch konventionelle Hellfeld chromogene multiplex IHC hat jedoch Einschränkungen, da es oft schwierig, mehrere Farbsignale auf einem einzigen Gewebe zuverlässig zu unterscheiden ist – vor allem für Antigene mit sehr geringe Expression4. Visuelle Beurteilung und Quantifizierung der Färbung auch kann subjektiv, Variabilität in der Analyse und Interpretation5verursachen.
Deshalb ist herkömmlichen IHC auf Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Proben nicht möglich für die simultane Detektion von mehreren Zielen bei immunologisch unterschiedlichen Erkrankungen wie Lymphom. Darüber hinaus ist die Unterscheidung neoplastischer Lymphozyten aus den umliegenden Immunzellen oft ungenau. Dies behindert den Studien über die Relevanz der neue Biomarker Lymphom. In diesem Zusammenhang multiplex fluoreszierende IHC (mf-IHC) bietet eine viel versprechende Alternative, da die quantitative Bewertung von Antigen Coexpression und eine räumliche Beziehung mit höherer Präzision bei gleichzeitiger Einsparung von begrenzt6,Proben7. Wenn diese imaging-Technologie eine mit der digitalen Bildanalyse-Software Partnerschaft ist, die Interpretation der Daten ist effizienter gestaltet und erleichtert das Studium der Tumor und Mikroumgebung Heterogenität8,9. In diesem Protokoll eine Tyramide-basierte Immunfluoreszenz (IF) multiplexing-Verfahren wird angewendet, um das Signal zu verstärken und ist kompatibel mit jedem IHC validiert Antikörper aus jedem Wirtsarten, auch diejenigen entwickelt, die in der gleichen Spezies5,7 , 10. Tyramide-basiertes Protokoll ermöglicht die direkte Konjugation der Fluorophor des Gewebes von Interesse, dass die primäre und sekundäre Antikörper nach jedem Schritt, die sequenzielle Anwendung mehrere Flecken entfernt werden kann ohne Antikörper Kreuzreaktivität.
Eine gebündelte Strategie wird für die Vorhersage Prognose und Behandlung Ergebnisse durch die Identifizierung von Zielen und deren Variante immunologischen Muster in Lymphome nützlich sein. Multiplex-Leuchtstofflampen IHC angewendet wurde in unserem Labor für die Studie eines Panels von T- und B-Lymphozyten und T-follikulären Helfer Marker Angioimmunoblastic T-Zell-Lymphom (AITL), ein Subtyp des eine periphere T-Zell-Lymphom zeichnet sich durch aggressive klinische Verhalten und Tumor Heterogenität11. Der Nutzen dieser Methode zeigt auch diffuse große B-Zell-Lymphom (DLBCL) wo die erhöhte Signalisierung eines B-Zell-Rezeptors mit gleichzeitiger C-MYC und BCL-2 Ausdruck den möglichen therapeutischen Einsatz von Brutons Tyrosin-Kinase Hemmung schlägt 12 . 
Hier beschreiben wir das gesamte Protokoll von Antikörper-Validierung, die Auswahl der angemessenen Kontrolle Gewebe und Multiplexen mit Lymphom FFPE Gewebe, mit einer späteren Analyse der gefärbten Folien mit einer Scan-automatisierte quantitative Pathologie Bildgebung System.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>REF S3022</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>For peroxide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra multispectral automated microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Vectra2.0.8</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1135</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF822001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF812001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL6</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-MYC</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy 5</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1171</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>Graph pad</td>
			<td></td>
			<td>Statisitcal software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoClear Clearing Agent</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H2779-1L</td>
			<td>Histoclear for dewaxing and clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced 
			Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Inform Software 2.2.1</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI67</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOS MILESTONE multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone</td>
			<td></td>
			<td>Microwave for Heat induced epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>PANASONIC</td>
			<td>NN-ST651M</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>81381 Aldrich Mowiol&#174; 4-88</td>
			<td>mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1488</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal520</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1487B21</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal540</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1494</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal620</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1495</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for tissue section adhesion in routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2367</td>
			<td>For HIER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer saline (TBS)</td>
			<td>1st BASE</td>
			<td>BUF3030 20X4L</td>
			<td>for buffer wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td>Tween</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma

Immunhistochemische (IHC) Methoden für die in-Situ -Analyse der Proteinexpression durch Lichtmikroskopie sind ein mächtiges Werkzeug für Forschung und Diagnostik. Die Visualisierung und Quantifizierung von mehreren Antigenen in einem einzigen Gewebe-Abschnitt mit konventionellen chromogenen IHC ist jedoch anspruchsvoll. Gemultiplexten Bildgebung ist besonders relevant in der Lymphom-Forschung und Diagnostik, wo Markierungen im Rahmen einer komplexen Tumor Mikroumgebung interpretiert werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll für Multiplex fluoreszierende IHC Färbung um die quantitative Bewertung der mehrere Ziele in bestimmten Zelltypen des Interesses an Lymphom zu ermöglichen. Die Methode umfasst Aspekte der Antikörper-Validierung, Antikörperoptimierung, die Multiplex-Optimierung mit Markern der Lymphom-Subtypen, die Färbung des Gewebes Microarray (TMA) rutschen und das Scannen von Dias, gefolgt von Datenanalyse, mit spezifischen Verweis auf Lymphom. Mit dieser Methode werden Noten für beide die mittlere Intensität der Marker für die Zinsen und die prozentuale Positivität generiert, um Quantitative Analyse weiter zu erleichtern. Multiplexen minimiert Probe Auslastung und bietet interessante räumliche Informationen für jede Markierung.

MF-IHC-Bilder für eine DLBCL Probe mit C-MYC und BCL2-gen-Umlagerung (Doppel-Hit Lymphom) sind in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 veranschaulicht die simulierten Hellfeld immunhistochemische Bilder. Abbildung 3 zeigt die Generation der Prozentsatz Daten. Abbildung 4 zeigt die Details einer medianen Formel für die Erzeugung von numerischen Daten. <strong class="xfig...

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Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Hier beschreiben wir ein Protokoll für Multiplex-fluoreszierende immunhistochemische Färbung und imaging für die gleichzeitige Lokalisierung von mehreren Krebs-assoziierte Antigene in Lymphom. Dieses Protokoll kann für die NS1 Analyse von Biomarkern in allen Gewebeschnitte erweitert werden.

Gemultiplexten fluoreszierende immunhistochemische Färbung, Bildverarbeitung und Analyse in histologischen Proben des Lymphoms

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

Lymphome sind histologisch komplexe Tumoren. Daher bietet multiplexierte fluoreszierende Immunhistochemie Vorteile gegenüber der herkömmlichen chromogenen Immunohistochemie, um Marker zu untersuchen, die für die Tumorzellen und die Mikroumgebung von Interesse sind. Diese Technik hat das Potenzial, die Bewertung von Antikörper-basierten Färbungen in histologischen Lymphomproben zu standardisieren, ein Prozess, der aufgrund der Komplexität der Tumormikroumgebung historisch schwierig war.Insbesondere multiplexierte fluoreszierende Immunhistochemie und Spektralbildgebung ermöglicht die quantitative Messung mehrerer Flecken innerhalb eines einzigen Dias, wodurch die Beurteilung der Antigen-Co-Expression und der räumlichen Beziehung innerhalb des klinischen Materials ermöglicht wird. Beginnen Sie mit dem Eintauchen der entwachsten und rehydrierten Dias in einen Standard-Antigen-Abrufpuffer in einer Mikrowelle, die Glas speichern und wärmeinduzierte Epitop-Retrieval in einer geeigneten Mikrowelle durchführen. Führen Sie zusätzliche Runden des Mikrowellen-Strippings basierend auf der Position des Antikörpers in der endgültigen Multiplexsequenz durch.Zum Beispiel erfordert der vierte Antikörper drei zusätzliche Runden Mikrowellen-Stripping vor der Färbung. Nach Abschluss des Abisoliervorgangs verwenden Sie Zangen und hitzebeständige Handschuhe, um die Dias bei Raumtemperatur für mindestens 10 Minuten abkühlend auf destilliertes Wasser zu übertragen. Wenn die Antigen-Retrieval-Lösung abgekühlt ist, blockieren Sie die Gewebeperoxidase-Aktivität mit einem kommerziellen Peroxidaseblock für 10 Minuten, gefolgt von einer fünfminütigen Wäsche in tris-gepufferter Salin, oder TBS, und einem nicht ionischen Reinigungsmittel.Blockieren Sie jede unspezifische Färbung mit einer 10-minütigen Inkubation im Sperrpuffer, gefolgt von inkubationsweise mit dem primären Antikörper von Interesse bei Raumtemperatur für 30 Minuten und drei fünfminütigen Waschungen mit TBS-D-Puffer. Anschließend die Proben mit einem geeigneten Meerrettichperoxidase konjugierten Sekundärantikörper für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, gefolgt von drei Waschungen im TBS-D-Puffer, wie gezeigt. Nach der letzten Wäsche ein geeignetes tyramidbasiertes fluoreszierendes Reagenz auf die Dias für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur auftragen, gefolgt von drei fünfminütigen TBS-D-Waschungen.Führen Sie eine zusätzliche Mikrowellen-basierte Stripping, um die primären und sekundären Antikörper in frischen Antigen-Retrieval-Lösung zu entfernen, wie gezeigt. Am Ende der Bergung die Dias in destilliertem Wasser abkühlen und die Bereiche auf den Dias ohne Gewebe mit Labortüchern trocknen. Inkubieren Sie Rutsche mit Dappy für 10 Minuten bei Raumtemperatur gefolgt von drei TBS-D-Waschungen.Trocknen Sie dann die Dias sorgfältig mit Labortüchern, ohne das Gewebe zu kontaktieren, und montieren Sie die Proben mit einem geeigneten Montagemedium für die Bildgebung. Wählen Sie für das Scannen von Monoplex-Dias die entsprechenden Filter aus den Fluorophoren aus, die für die Kennzeichnung der Proben verwendet werden, und untersuchen Sie jeden Marker und den entsprechenden Fluoreszenzkanal, um eine geeignete Belichtungszeit für die Gewinnung eines sauberen Signals zu ermitteln, wobei der Schwerpunkt auf der Gewebekomponente liegt, die das stärkste Signal für den Marker aufweisen sollte. Um einen vergleichungsübergreifender Pixelintensität zu ermöglichen, verwenden Sie die Einstellung der Live-Kamera, um die Belichtungszeit in jedem einzelnen Kanal anzupassen, bis sich keine überbelichteten Bereiche im Live-Kamerabild befinden.Wenn alle Dias gescannt wurden, erfassen Sie simulierte helle Feldbilder, um sie visuell mit dem normalen immunhistochemischen Muster zu vergleichen und um festzustellen, ob das Färbemuster korrekt ist. Um Gewebe-Mikroarray-Dias zu scannen, verwenden Sie den Gewebe-Mikroarray-Scan-Modus im Bildgebungssystem und einen geeigneten Autofokus-Algorithmus. Lassen Sie die Dias für ganze Gewebeteilfolien von einem qualifizierten Pathologen überprüfen, um optimale Bilder aus den repräsentativsten Tumorbereichen auszuwählen.Bevor Sie mit der Analyse beginnen, wählen Sie einen Tumormarker aus, um die für die Analyse von Interesse endenden Zellen zu identifizieren. Lassen Sie einen Pathologen die Bilder überprüfen und entscheiden, ob eine Gewebesegmentierung erforderlich ist. Wählen Sie bei Bedarf die entsprechenden Kontrollbereiche für die Segmentierung aus und überprüfen Sie, ob die Bildanalysesoftware solche Regionen korrekt identifizieren kann.Lassen Sie nach der Zellsegmentierung den Pathologen die Segmentierungskarte überprüfen, um die Genauigkeit des beabsichtigten Segmentierungsansatzes sicherzustellen, und überprüfen Sie einzelne Bilder, um festzustellen, ob die Zellsegmentierung angemessen ist oder ob eine zusätzliche Gewebesegmentierung erforderlich ist, um Regionen auszuwählen, die für Tumorzellen, Stroma und Nekrose angereichert sind. Bestimmen Sie dann den optischen Intensitäts-positiven Cutoff-Wert für jeden Marker in Verbindung mit dem Pathologen und generieren Histogramme in einem geeigneten Statistik-Softwareprogramm, um die Frequenzverteilung der Markerintensität pro Zelle zu analysieren. Um prozentuale Daten für bestimmte Interessenspunkte innerhalb definierter Zellen zu generieren, fügen Sie eine Pivot-Tabelle in das Datenblatt ein, und wählen Sie Summe aus, um den Positivitätsprozentsatz einer einzelnen Interessenmarkierung zu berechnen.Die Gesamtzahl der Marker-positiven Zellen dividiert durch die Gesamtzahl wird berechnet. Das Ergebnis ist der Marker-positive Zellprozentsatz mit einem Kern oder einer Studiennummer. Um numerische Daten zu generieren, erhalten Sie die mittlere Intensität jedes Markers, der für alle Zellen in einer Stichprobe untersucht wird, um die mediane normalisierte Anzahl für jeden Marker jedes Kerns oder jeder Studiennummer zu extrahieren.Hier werden repräsentative multiplexfluoreszierende immunhistochemische Bilder für eine diffuse große B-Zell-Lymphomprobe mit c-MYC- und BCL2-Genumlagerung gezeigt. Simulierte immunhistochemische Hellfeldbilder zeigen ein ähnliches Tumormarker-Färbungsmuster. Die Anwendung von multiplexfluoreszierenden immunhistochemischen Bildern auf ein T-Zell-Panel bei angioimmunoblastischen T-Zell-Lymphomen zeigt die Zellheterogenität der Tumorprobe.Hier werden die Optimierung einer Tonsillenkontrollprobe und die daraus resultierende Datenanalyse dargestellt. Eine Vielzahl von Bildanalyse-Software-Programme können nach dem Unmix-Schritt verwendet werden, um Markerexpression und Lokalisierung in Tumorzellen und der Tumormikroumgebung zu quantitieren. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, die Koexpression mehrerer Marker innerhalb bestimmter Zelltypen in einzelnen Gewebeabschnitten des Lymphoms zu untersuchen.Achten Sie darauf, hitzeinduzierte Verletzungen während der Mikrowaving-Schritte zu verhindern und sich der Sturzrisiken während der Scanschritte bewusst zu sein, die im Deck durchgeführt werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

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Ableitung von Thymuslymphom T-Zell-Linien aus Atm - / -</sup Und P53 - / -</sup Mäuse

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Forschung

Immunologie und Infektion

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