Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma at JoVE.com

ס-תרגוםאולפני ו- A.D.J. נתמכים על ידי נבחרת רפואי מחקר מועצת המעבר פרסים של סינגפור משרד הבריאות (NMRC/ת א/0020/2013 ו- NMRC/ת א/0052/2016). המחברים לאשר מענק מחקר יונג יון Siew כדי A.D.J. מ באוניברסיטה הלאומית סרטן המכון של סינגפור לקראת רכישת מיקרוסקופ הדמיה ספקטרלי וקטרה. מחקר זה אושרה על ידי סינגפור NHG תחום ספציפי סקירה לוח B (2014/00693).

לכל רקמות בשימוש פרוטוקול זה התקבלו תחת סינגפור NHG תחום ספציפי סקירה לוח B ללמוד 2014/00693.
1. בחירת ובדיקת נוגדנים
הערה: לפני שתמשיך עם הממסד של חלונית מרובבת, ודא כי נוגדנים כל כתם robustly, זיהוי רק היעד אנטיגן עניין. המטרה היא לבחור נוגדנים במיוחד מזהה אנטיגן עניין בס...

<ol>
	<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+revision+of+the+World+Health+Organization+classification+of+lymphoid+neoplasms.">The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms.</a> Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).</li><li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).</li><li>Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+for+Pathologists:+Protocols,+Pitfalls,+and+Tips.">Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+profiling+of+lymphoma.">Immunohistochemical profiling of lymphoma.</a> Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).</li><li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues.">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li><li>Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+Quantitative+Analysis+of+Protein+Expression.">Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Visualization+of+Multiple+Antigens+with+Tyramide+Signal+Amplification+using+Antibodies+from+the+same+Species.">Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Ng, S. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+a+Multiplexed+Immunofluorescence+Panel+in+T-Cell+Lymphoma.">Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma.</a> SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).</li><li>Bogusz, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+large+B-cell+lymphoma+with+concurrent+high+MYC+and+BCL2+expression+shows+evidence+of+active+B-cell+receptor+signaling+by+quantitative+immunofluorescence.">Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).</li><li>Kalyuzhny, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).</li><li>Bordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+validation.">Antibody validation.</a> BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual. , (2012).</li><li>Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+beyond+P+values:+Everyday+data+analysis+with+estimation+plots.">Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+Imaging+of+T+and+B+Cells+in+Murine+Spleen+and+Tumor.">Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor.</a> The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).</li></ol>

mf-IHC יש הפוטנציאל לאפשר פתולוגים לעידון diagnosticcriteria בפתולוגיה הלימפה, כדי לנתח את התפקיד של סמנים ביולוגיים סוגי תאים ספציפיים לכיוון חיזוי של התוצאה הקלינית. כשיטת מחקר חדש, mf-IHC מוחלת יותר ויותר על הזיהוי המרחבי וסטטיסטי של פרמטרים מרובים המערכת החיסונית של תאי הגידול17. הגילו?...

Neoplasms הלימפה נגרמות על ידי מבוקרת ממאיר של לימפוציטים. תאים אלה הם מרכיבים חיוניים של המערכת החיסונית, בתרגום לאיברים המערכת החיסונית ראשוני ומשני, כגון מח העצם, בלוטות הלימפה, טחול, מערכת הלימפה אחרים רירית הקשורים. Neoplasms הלימפה הם קבוצה הטרוגנית של הפרעות אשר מסווגים מבוסס על מערך של תכונות, כולל מורפולוגיה, immunophenotype, תכונות גנטיות של המצגת קליניים. בעוד כל פרמטר ממלא חלק, שושלת היוחסין נשאר המגדיר תכונה ו מהווה את הבסיס עבור מערכת סיווג WHO אשר מזהה neoplasms שמקורם בתאי B ותאי T, טבעי רוצח (NK) תאים1.
המפתח הסיווג של לימפומה כבר אפיון הנוגדנים נגד ליקוציט סמני פני השטח של תתי סוגים שונים של לימפוציטים2. אימונוהיסטוכימיה (IHC) משמשת לניתוח של סמנים כזה והיא מבוססת על העיקרון של ההכרה אנטיגן-נוגדן ספציפי כדי לזהות מולקולות תאים רקמות מבוססות להיות visualized באמצעות מיקרוסקופ אור 3. עם זאת, הזיהוי של מטרות מרובות בשקופית אחת מאת בהיר-שדות קונבנציונלי IHC מולטיפלקס הדפסות כסף יש מגבלות מאחר שלעיתים קשה להבחין אותות צבע מרובים על קטע רקמה אחת אמינה — במיוחד עבור אנטיגנים עם ביטוי נמוך4. הערכה חזותית כימות של צביעת ניתן גם סובייקטיבית, גורם השתנות ניתוח ונתונים לפרשנות5.
לכן, IHC המקובלת על דגימות (FFPE) פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע אינו ריאלי עבור גילוי סימולטני של מטרות מרובות במחלות immunologically מגוונות כמו לימפומה. יתר על כן, הבחנה לימפוציטים אמצעים מתאי מערכת החיסון שמסביב לעתים קרובות מדויק. זה מעכבת מחקרים מסתכל על הרלוונטיות של סמנים חדשניים לימפומה. בהקשר זה, IHC מולטיפלקס פלורסנט (mf-IHC) מציע חלופה מבטיח כמו זה מאפשר את הערכה כמותית של אנטיגן coexpression יחסים מרחביים עם דיוק גבוה יותר תוך שימור מוגבלת דגימות6,7. כאשר טכנולוגיית הדמיה זו היא שותפות עם התוכנה ניתוח תמונה דיגיטלי, פרשנות הנתונים מורכב יותר יעיל ואסטמה ומקילה על המחקר של הגידול, microenvironment הטרוגניות8,9. ב פרוטוקול זה, המבוסס על tyramide immunofluorescence (אם) שיטת ריבוב מוחל כדי להיקלט והוא תואם עם כל נוגדן IHC לאמת של כל מין המארח, אפילו אלה שפותחו ב-5,מינים באותו7 , 10. פרוטוקול מבוסס-tyramide מאפשר ההטיה ישירה של fluorophore לרקמות של הריבית כך נוגדן ראשוני ומשני ניתן הברקה לאחר כל שלב, המאפשרות יישום רציף של כתמים מרובים ללא נוגדנים אשיג.
אסטרטגיה מרובבת תהיה שימושית לניבוי תוצאות פרוגנוזה וטיפול על ידי זיהוי מטרות ודפוסי שלהם משתנה אוטואימונית ב לימפומות. מולטיפלקס פלורסנט IHC הוחל שלנו במעבדה לחקר פאנל של סמנים T ו- B לימפוציטים, סמני helper T-הזקיקים angioimmunoblastic T-cell לימפומה (AITL), תת סוג של לימפומה T-cell היקפיים מאופיין על ידי אגרסיבי קליני ההתנהגות ואת הגידול הטרוגניות11. השירות של שיטה זו מומחש גם ב- ' מאטום לשקוף ' B-cell לימפומה גדולים (DLBCL) איפה האיתות מוגברת של קולטן B-cell עם C-MYC סימולטני והביטוי BCL-2 מרמז על השימוש טיפולית פוטנציאל טירוזין קינאז עיכוב של ברוטון 12 . 
כאן נתאר פרוטוקול כולו של נוגדן אימות לבחירה של רקמות הפקד המתאים ואת ריבוב באמצעות לימפומה FFPE רקמות, עם ניתוח בסופו של דבר של ויטראז'ים השקופיות באמצעות סריקה של כלים אוטומטיים הפתולוגיה הכמותית הדמיה מערכת.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>REF S3022</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>For peroxide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra multispectral automated microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Vectra2.0.8</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1135</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF822001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF812001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL6</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-MYC</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy 5</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1171</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>Graph pad</td>
			<td></td>
			<td>Statisitcal software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoClear Clearing Agent</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H2779-1L</td>
			<td>Histoclear for dewaxing and clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced 
			Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Inform Software 2.2.1</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI67</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOS MILESTONE multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone</td>
			<td></td>
			<td>Microwave for Heat induced epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>PANASONIC</td>
			<td>NN-ST651M</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>81381 Aldrich Mowiol&#174; 4-88</td>
			<td>mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1488</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal520</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1487B21</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal540</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1494</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal620</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1495</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for tissue section adhesion in routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2367</td>
			<td>For HIER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer saline (TBS)</td>
			<td>1st BASE</td>
			<td>BUF3030 20X4L</td>
			<td>for buffer wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td>Tween</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma

Immunohistochemical (IHC) שיטות לניתוח מקומיים של ביטוי חלבונים על ידי מיקרוסקופ אור הן כלי רב עוצמה עבור המחקר והן למטרות אבחון. עם זאת, ויזואליזציה של כימות של אנטיגנים מרובים במקטע בודד רקמות באמצעות IHC הדפסות כסף קונבנציונלי הוא מאתגר. הדמיה מרובבת רלוונטי במיוחד לימפומה מחקר, אבחון, שבו סמני צריך לפרש בהקשר של microenvironment הגידול מורכב. כאן נתאר פרוטוקול עבור מרובבת IHC פלורסנט מכתים כדי לאפשר את הערכה כמותית של מטרות מרובות סוגי תאים ספציפיים עניין בלימפומה. השיטה מכסה היבטים של נוגדן אימות, נוגדן אופטימיזציה, אופטימיזציה מולטיפלקס עם סמנים של סוגי לימפומה, צביעה של רקמת microarray (TMA) שקופיות ולאחר סריקה של השקופיות, ואחריו ניתוח נתונים, ספציפיות התייחסות לימפומה. באמצעות שיטה זו, הציונים של עוצמת בשני אכזרי של סמן של עניין את הגישה החיובית אחוז נוצרים כדי להקל עוד יותר על אנליזה כמותית. ריבוב ממזער מדגם ניצול ומספק מידע מרחבי עבור כל סמן עניין.

mf-IHC תמונות עבור מדגם DLBCL עם C-MYC ו שחלוף ג'ין BCL2 (כפול פגע לימפומה) מוצגים באיור1. איור 2 מדגים את התמונות immunohistochemical בהיר-שדה מדומה. איור 3 מציין את הדור של הנתונים באחוזים. איור 4 מציג את הפרטים של נוסחה החציוני ?...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma at JoVE.com

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

כאן נתאר פרוטוקול עבור מולטיפלקס immunohistochemical פלורסנט מכתים והדמיה עבור ההתאמה סימולטני של אנטיגנים מרובים הקשורים לסרטן ב לימפומה. פרוטוקול זה ניתן להרחיב את הניתוח colocalization של סמנים ביולוגיים בתוך כל מקטעי רקמת.

מרובבת פלורסנט נוגדן, הדמיה, וניתוח בדגימות היסטולוגית של לימפומה

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

לימפומות הן גידולים מורכבים מבחינה היסטולוגית. לכן, אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מרובת-פלקסים מציעה יתרונות על פני אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית קונבנציונלית כדי לחקור סמנים של עניין בתאי הגידול ובמיקרו-וירוס. טכניקה זו יש פוטנציאל סטנדרטיזציה של ניקוד של כתמים מבוססי נוגדנים בדגימות לימפומה היסטולוגית, תהליך זה היה מאתגר מבחינה היסטורית בשל המורכבות של microenvironment הגידול.באופן ספציפי, אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מרובת-פלקסים והדמיה ספקטרלית מאפשרת מדידה כמותית של כתמים מרובים בתוך שקופית אחת, ובכך מאפשרת הערכה של ביטוי אנטיגן שותף וקשרי ספאל בתוך חומר קליני. התחל על ידי טבילת שקופיות de-waxed ו rehydrated במאגר אחזור אנטיגן סטנדרטי בצנצנת זכוכית לחסוך במיקרוגל וביצוע אחזור epitope הנגרמת על ידי חום במיקרוגל מתאים. בצע סבבים נוספים של הפשטת מיקרוגל בהתבסס על מיקום הנוגדן ברצף מולטיפלקס הסופי.לדוגמה, הנוגדן הרביעי דורש שלושה סבבים נוספים של הפשטת מיקרוגל לפני הכתמה. לאחר השלמת תהליך החשפנות, יש להשתמש במדפים ובכפפות חסינות חום כדי להעביר את המגלשות למים מזוקקים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפחות. כאשר פתרון אחזור אנטיגן התקרר, לחסום את פעילות peroxidase הרקמה עם בלוק peroxidase מסחרי במשך 10 דקות ואחריו לשטוף חמש דקות מלוחים טריס-buffered, או TBS, ודטרגנט לא יוני.לחסום כל כתמים לא ספציפיים עם דגירה של 10 דקות במאגר חסימה ואחריו דגירה עם הנוגדן העיקרי של עניין בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות ושלוש חמש דקות שוטף עם חיץ TBS-D. לאחר מכן, הדגירה את הדגימות עם peroxidase חזרת מתאימה תרכובת נוגדן משני במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו שלוש שטיפות במאגר TBS-D כפי שהוכח. לאחר הכביסה האחרונה, יש למרוח רהט פלואורסצנטי מתאים המבוסס על טיראמיד על השקופיות במשך חמש דקות דגירה בטמפרטורת החדר ואחריה שלוש שטיפות TBS-D של חמש דקות.בצע הפשטה נוספת מבוססת מיקרוגל כדי להסיר את הנוגדנים העיקריים והמשניים בתתסמת אחזור אנטיגן טרי כפי שהוכח. בסוף האחזור, מקררים את המגלשות במים מזוקקים ומייבשים את האזורים במגלשות ללא רקמה עם מגבוני מעבדה. דגירה להחליק עם dappy במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו שלוש שטיפות TBS-D.לאחר מכן, בזהירות לייבש את השקופיות עם מגבונים במעבדה מבלי ליצור קשר עם הרקמות ולהרים את הדגימות עם מדיום הרכבה מתאים להדמיה. לסריקת שקופיות מונופלקס, בחר את המסננים המתאימים מהפלורופורים המשמשים לתיוג הדגימות ובחן כל סמן ואת ערוץ הפלואורסצנטיות המתאים לו כדי לזהות זמן חשיפה מתאים לקבלת אות נקי, תוך התמקדות ברכיב הרקמה שאמור להיות האות החזק ביותר עבור הסמן. כדי לאפשר השוואה בין דגימות של עוצמת הפיקסל, השתמש בהגדרת המצלמה החיה כדי לכוונן את זמן החשיפה בכל ערוץ בודד עד שלא יהיו אזורים עם חשיפת יתר בתצלום המצלמה החיה.לאחר סריקת כל השקופיות, רכוש תמונות שדה בהיר מדומה כדי להשוות באופן חזותי לתבנית האימונוהיסטוכימית הרגילה ולקבוע אם תבנית הכתמים נכונה. כדי לסרוק שקופיות microarray רקמות, להשתמש במצב סריקת microarray רקמות במערכת ההדמיה ואלגוריתם מיקוד אוטומטי מתאים. עבור שקופיות סעיף רקמה שלמה, יש את השקופיות נבדקו על ידי פתולוג מוסמך כדי לבחור תמונות אופטימליות מאזורי הגידול המייצגים ביותר.לפני תחילת הניתוח, בחר סמן גידול כדי לזהות את התאים המעניינים לניתוח. יש פתולוג לסקור את התמונות ולהחליט אם פילוח רקמות נדרש. במידת הצורך, בחר את אזורי הבקרה המתאימים לפילוח ובדוק אם תוכנת ניתוח התמונה יכולה לזהות כראוי אזורים כאלה.לאחר פילוח התאים, תן לפתולוג לסקור את מפת הפילוח כדי להבטיח את נאמנותה של גישת הפילוח המיועדת וסקור תמונות בודדות כדי לקבוע אם פילוח התאים מתאים או אם נדרש פילוח רקמות נוסף כדי לבחור אזורים מועשרים עבור תאים סרטניים, סטרומה או נמק. לאחר מכן לקבוע את ערך ניתוק חיובי בעוצמה אופטית עבור כל סמן בשילוב עם הפתולוג וליצור היסטוגרמות בתוכנה סטטיסטית מתאימה כדי לנתח את התפלגות התדירות של עוצמת הסמן לכל תא. כדי ליצור נתוני אחוזים עבור סמנים ספציפיים של עניין בתוך תאים מוגדרים, הוסף טבלת ציר לתוך גליון הנתונים ובחר Sum כדי לחשב את אחוז החיוביות של סמן עניין יחיד.המספר הכולל של תאים חיוביים של סמן חלקי המספר הכולל יחושב. התוצאה היא אחוז התא החיובי של הסמן עם ליבה אחת, או מספר מחקר אחד. כדי ליצור נתונים מספריים, השג את העוצמה הממוצעת של כל סמן עניין בכל התאים לחקור בתוך מדגם כדי לחלץ את הספירה מנורמל חציון עבור כל סמן של כל ליבה או מספר מחקר.כאן, תמונות אימונוהיסטוכימיות פלואורסצנטיות ייצוגיות עבור דגימת לימפומה גדולה מפוזרת של תאי B עם סידור מחדש של גנים c-MYC ו- BCL2 מוצגים. תמונות אימונוהיסטוכימיות של שדה בהיר מדומה מדגימות דפוס כתמים דומה של סמן גידול. היישום של תמונות אימונוהיסטוכימיות פלואורסצנטיות מולטיפלקס לפאנל תאי T בלימפומות תאי T אנגיואימונובלסטיות חושף את ההטרוגניות התאית של דגימת הגידול.כאן, האופטימיזציה של דגימת בקרת שקדים וניתוח הנתונים המתקבל מוצגים. ניתן להשתמש במגוון תוכנות לניתוח תמונה לאחר השלב הבלתי מעורער לכמת ביטוי סמן ולוקליזציה בתאי הגידול ובמיקרו-וירוס הגידול. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים ללמוד את הביטוי השותף של סמנים מרובים בתוך סוגי תאים ספציפיים בחלקים רקמות בודדות של לימפומה.יש לדאוג כדי למנוע פגיעה הנגרמת על ידי חום במהלך שלבי microwaving להיות מודעים לסיכוני נפילה במהלך שלבי הסריקה המבוצעים בסיפון.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

גזירת הרתי T-cell לימפומה קווים מ כספומט - / -</sup ו P53 - / -</sup עכברים

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

השימוש פלורסנט חיסונית-לכימיה לצורך זיהוי של Edwardsiella ictaluri ב שפמנון ערוץ ( א punctatus) דגימות

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

לא פולשני<em&gt; בויבו</em&gt; פלואורסצנטי הדמיה אופטית של פעילות MMP דלקתית באמצעות Activatable פלואורסצנטי סוכן הדמיה

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

מאוד מרבב, סופר ברזולוציה הדמיה של תאים T באמצעות madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

ניצול של קפסולות עבור מכתים שלילי של דגימות ויראלי בתוך Biocontainment

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

כימות היסטולוגית כדי לקבוע נטל פטרייתי ריאות ב Aspergillosis ניסיוני

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

באמצעות מערכות רובוטיות כדי לעבד ולהטביע דגימות מאתר חוקן עבור ניתוחים היסטולוגית

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

מעקב משופר כלבת באמצעות מבחן אימונוהיסטוכימיה ישירה מהירה

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...