Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00
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S.-B.N. e a.d.j. sono supportati da National Medical Research Consiglio transizione Awards di Singapore Ministero della salute (NMRC/TA/0020/2013 e NMRC/TA/0052/2016). Gli autori riconoscono un Yong Siew Yoon Research Grant per A.D.J National University Cancer Institute di Singapore verso l'acquisto di un microscopio di imaging spettrale di Vectra. Questo studio è approvato dal Singapore NHG dominio specifico Review Board B (2014/00693).

Tutti i tessuti utilizzati in questo protocollo sono stati ottenuti sotto Singapore NHG dominio specifico Review Board B studiare 2014/00693.
1. selezione e validazione degli anticorpi
Nota: Prima di procedere con la creazione di qualsiasi pannello multiplex, assicurarsi che tutti gli anticorpi macchiare robustamente, identificare solo l'antigene target di interesse. L'obiettivo è quello di selezionare gli anticorpi che riconoscono specificamente l'antigene di intere...

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MF-IHC ha il potenziale per abilitare i patologi per perfezionare diagnosticcriteria in patologia linfoide e di analizzare il ruolo dei biomarcatori in tipi cellulari specifici verso un pronostico del risultato clinico. Come un nuovo metodo di ricerca, mf-IHC è sempre più applicate all'identificazione quantitativa e spaziale dei parametri immuni multipli del tumore le cellule17. La rilevazione di mf-IHC per la co-espressione di biomarcatori del tumore ha dimostrata di essere affidabile e riprodu...

Neoplasie linfoidi sono causati dalla incontrollata proliferazione maligna dei linfociti. Queste cellule sono componenti fondamentali del sistema immunitario e si localizzano gli organi immuni primari e secondari, quali il midollo osseo, nei linfonodi, milza e altri sistema linfoide mucosa-collegato. Neoplasie linfoidi sono un gruppo eterogeneo di disordini che sono classificati basato su una costellazione di caratteristiche, tra cui morfologia, immunofenotipo, caratteristiche genetiche e presentazione clinica. Mentre ogni parametro svolge un ruolo, lignaggio rimane una caratteristica distintiva e costituisce la base per il sistema di classificazione del WHO che riconosce neoplasma derivati dalle cellule B, cellule T e natural killer (NK) cellule1.
Chiave per la classificazione di linfoma è stata la caratterizzazione degli anticorpi contro gli indicatori della superficie del leucocita dei vari sottotipi di linfociti2. Immunohistochemistry (IHC) è stato tradizionalmente usato per l'analisi di tali indicatori e si basa sul principio del riconoscimento antigene-anticorpo specifico per rilevare molecole cellulari e tissutali che possono essere visualizzati attraverso il microscopio ottico 3. Tuttavia, l'identificazione di bersagli multipli su una singola diapositiva di convenzionale campo chiaro cromogenico multisala IHC ha limitazioni perché spesso è difficile distinguere attendibilmente più segnali di colore su una sezione di tessuto singolo — soprattutto per gli antigeni con un' espressione molto bassa4. Valutazione visiva e quantificazione di colorazione può anche essere soggettivi, causando la variabilità nella interpretazione analisi e dati5.
Di conseguenza, IHC convenzionale su campioni di formalina-fisse, paraffina (FFPE) non è fattibile per la rilevazione simultanea di più destinazioni in immunologicamente diverse malattie come il linfoma. Inoltre, distinguendo i linfociti neoplastici dalle cellule immuni circostante è spesso impreciso. Questo ostacola studi esaminando la rilevanza di nuovi biomarcatori nel linfoma. In questo contesto, multisala fluorescente IHC (mf-IHC) rappresenta un'alternativa promettente poiché permette la valutazione quantitativa della coexpression di antigene e un rapporto spaziale con maggiore precisione, conservando limitato campioni6,7. Quando questa tecnologia di imaging è una partnership con il software di analisi di immagine digitale, l'interpretazione dei dati è reso più efficiente e facilita lo studio del tumore e microambiente eterogeneità8,9. In questo protocollo, un basati su microarray immunofluorescenza (IF) multiplexing metodo viene applicato per amplificare il segnale ed è compatibile con qualsiasi anticorpo IHC-convalidato da qualsiasi specie di ospiti, anche quelli sviluppati nella stessa specie5,7 , 10. il protocollo basato su microarray permette per la coniugazione diretta del fluoroforo al tessuto di interesse affinché l'anticorpo primario e secondario possa essere rimossi dopo ogni passaggio, consentendo l'applicazione sequenza di macchie multiple senza cross-reattività dell'anticorpo.
Una strategia di "multiplex" sarà utile per stimare la prognosi ed il trattamento risultati identificando obiettivi e loro modelli variant immunologiche nei linfomi. Multisala fluorescenti IHC è stato applicato nel nostro laboratorio per lo studio di un pannello di marcatori di T e dei linfociti B e T-follicolare helper nel linfoma a cellula T angioimmunoblastic (AITL), un sottotipo di un linfoma a cellula T periferico caratterizzato da aggressivo clinica comportamento e tumore eterogeneità11. L'utilità di questo metodo è illustrato anche nel linfoma diffuso della B-cellula grande (DLBCL) dove la segnalazione aumentata di un recettore della B-cellula con espressione simultanea di C-MYC e BCL-2 suggerisce il potenziale impiego terapeutico di inibizione di chinasi della tirosina di Bruton 12 . 
Qui descriviamo l'intero protocollo dalla convalida dell'anticorpo alla selezione dei tessuti di controllo appropriato e multiplexing con linfoma FFPE tessuti, con un'eventuale analisi di vetrini colorati utilizzando una scansione automatizzata imaging quantitativo patologia sistema.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>REF S3022</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>For peroxide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra multispectral automated microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Vectra2.0.8</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1135</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF822001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF812001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL6</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-MYC</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy 5</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1171</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>Graph pad</td>
			<td></td>
			<td>Statisitcal software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoClear Clearing Agent</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H2779-1L</td>
			<td>Histoclear for dewaxing and clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced 
			Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Inform Software 2.2.1</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI67</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOS MILESTONE multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone</td>
			<td></td>
			<td>Microwave for Heat induced epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>PANASONIC</td>
			<td>NN-ST651M</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>81381 Aldrich Mowiol&#174; 4-88</td>
			<td>mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1488</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal520</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1487B21</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal540</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1494</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal620</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1495</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for tissue section adhesion in routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2367</td>
			<td>For HIER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer saline (TBS)</td>
			<td>1st BASE</td>
			<td>BUF3030 20X4L</td>
			<td>for buffer wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td>Tween</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma

Metodi di immunoistochimica (IHC) per l'analisi in situ di espressione della proteina da microscopia chiara sono un potente strumento per la ricerca sia gli scopi diagnostici. Tuttavia, la visualizzazione e la quantificazione degli antigeni multipli in un singolo tessuto sezione utilizzando convenzionali cromogenico IHC è impegnativo. Multiplex imaging è particolarmente rilevante nella ricerca di linfoma e di diagnostica, dove gli indicatori devono essere interpretate nel contesto di un microambiente tumorale complesse. Qui descriviamo un protocollo per multiplex fluorescente IHC che macchia per permettere la valutazione quantitativa di bersagli multipli in tipi cellulari specifici di interesse nel linfoma. Il metodo copre gli aspetti della convalida dell'anticorpo, ottimizzazione dell'anticorpo, l'ottimizzazione multiplex con marcatori di sottotipi di linfoma, la colorazione dei vetrini di tessuto microarray (TMA) e la scansione delle diapositive, seguita da analisi dei dati, con specifico riferimento per linfoma. Spartiti per sia l'intensità media di un marcatore di interesse e la percentuale di positività, utilizzando questo metodo, vengono generati per facilitare ulteriormente l'analisi quantitativa. Multiplexing riduce al minimo l'utilizzo di esempio e vengono fornite informazioni spaziali per ogni indicatore di interesse.

immagini di MF-IHC per un campione DLBCL con C-MYC e riorganizzazione di gene BCL2 (doppio-colpisca linfoma) sono mostrati nella Figura 1. La figura 2 illustra le immagini simulate campo chiaro immunohistochemical. Figura 3 indica la generazione dei dati di percentuale. Figura 4 Visualizza i dettagli di una formula mediana per la generazione di dati numerici. <strong cla...

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Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Qui descriviamo un protocollo per multiplex immunohistochemical fluorescente di colorazione e di imaging per la localizzazione simultanea di più antigeni tumore-associati nel linfoma. Questo protocollo può essere esteso all'analisi di colocalizzazione dei biomarcatori all'interno di tutte le sezioni di tessuto.

La macchiatura di Immunohistochemical fluorescente multiplex, Imaging e analisi in campioni istologici di linfoma

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

I linfomi sono tumori istologicamente complessi. Pertanto, l'immunoistochimica fluorescente multiplexata offre vantaggi rispetto all'immunoistochimica cromogenica convenzionale per studiare marcatori di interesse nelle cellule tumorali e nel microambiente. Questa tecnica ha il potenziale per standardizzare il punteggio della colorazione a base di anticorpi in campioni di linfoma istologico, un processo che storicamente è stato impegnativo a causa della complessità del microambiente tumorale.In particolare, l'immunoistochimica fluorescente multiplexata e l'imaging spettrale consentono la misurazione quantitativa di più macchie all'interno di un singolo scivolo, consentendo così la valutazione della coesposizione dell'antigene e della relazione spettrale all'interno del materiale clinico. Inizia immergendo le diapositive de-cerate e reidratate in un tampone standard di recupero dell'antigene in un barattolo di vetro a microonde e eseguendo il recupero dell'epitopo indotto dal calore in un forno a microonde adatto. Eseguire cicli aggiuntivi di stripping a microonde in base alla posizione dell'anticorpo nella sequenza multiplex finale.Ad esempio, il quarto anticorpo richiede tre cicli aggiuntivi di stripping a microonde prima della colorazione. Dopo aver completato il processo di stripping, utilizzare le forcette e i guanti a prova di calore per trasferire gli scivoli in acqua distillata a temperatura ambiente per almeno 10 minuti di raffreddamento. Quando la soluzione di recupero dell'antigene si è raffreddata, bloccare l'attività della perossidasi tissutale con un blocco di perossidasi commerciale per 10 minuti seguito da un lavaggio di cinque minuti in soluzione salina tris-tamponata, o TBS, e un detergente non ionico.Bloccare qualsiasi colorazione non specifica con un'incubazione di 10 minuti nel tampone di blocco seguita da incubazione con l'anticorpo primario di interesse a temperatura ambiente per 30 minuti e tre lavaggi di cinque minuti con tampone TBS-D. Successivamente, incubare i campioni con un anticorpo secondario coniugato di rafano perossidasi appropriato per 15 minuti a temperatura ambiente, seguito da tre lavaggi nel tampone TBS-D come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, applicare un reagente fluorescente appropriato a base di tiroide alle diapositive per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente seguita da tre lavaggi TBS-D di cinque minuti.Eseguire uno stripping aggiuntivo a base di microonde per rimuovere gli anticorpi primari e secondari nella soluzione di recupero dell'antigene fresco, come dimostrato. Al termine del recupero, raffreddare gli scivoli in acqua distillata e asciugare le aree sugli scivoli senza tessuto con salviette da laboratorio. Incubare lo scivolo con dappy per 10 minuti a temperatura ambiente seguito da tre lavaggi TBS-D.Quindi, asciugare accuratamente le diapositive con salviette da laboratorio senza contattare i tessuti e montare i campioni con un mezzo di montaggio appropriato per l'imaging. Per la scansione a scorrimento monoplex, selezionare i filtri appropriati dai fluorofori utilizzati per etichettare i campioni ed esaminare ogni marcatore e il corrispondente canale di fluorescenza per identificare un tempo di esposizione adatto per ottenere un segnale pulito, concentrandosi sul componente tissutale che dovrebbe avere il segnale più forte per il marcatore. Per consentire il confronto tra campioni dell'intensità dei pixel, utilizzare l'impostazione della fotocamera dal vivo per regolare il tempo di esposizione in ogni singolo canale fino a quando non vi sono aree sovraesposte nell'immagine della fotocamera dal vivo.Una volta scansionate tutte le diapositive, acquisire immagini simulate di campo luminoso da confrontare visivamente con il normale modello immunoistochimico e determinare se il modello di colorazione è corretto. Per scansionare diapositive di microarray tissutale, utilizzare la modalità di scansione del microarray tissutale nel sistema di imaging e un algoritmo di messa a fuoco automatica appropriato. Per le diapositive di sezione di tessuto intero, far rivedere le diapositive da un patologo qualificato per selezionare immagini ottimali dalle aree tumorali più rappresentative.Prima di iniziare l'analisi, selezionare un marcatore tumorale per identificare le cellule di interesse per l'analisi. Chiedere a un patologo di rivedere le immagini e decidere se è necessaria la segmentazione dei tessuti. Se necessario, selezionare le aree di controllo appropriate per la segmentazione e verificare se il software di analisi delle immagini è in grado di identificare correttamente tali aree.Dopo la segmentazione cellulare, chiedere al patologo di rivedere la mappa di segmentazione per garantire la fedeltà dell'approccio di segmentazione previsto e rivedere le singole immagini per determinare se la segmentazione cellulare è adeguata o se è necessaria una segmentazione dei tessuti aggiuntiva per selezionare le regioni arricchite per cellule tumorali, stroma e o necrosi. Quindi determinare il valore di taglio positivo dell'intensità ottica per ogni marcatore in combinazione con il patologo e generare istogrammi in un programma software statistico appropriato per analizzare la distribuzione della frequenza dell'intensità del marcatore per cella. Per generare dati percentuali per marcatori di interesse specifici all'interno di celle definite, inserire una tabella pivot nel foglio dati e selezionare Somma per calcolare la percentuale di positività di un singolo marcatore di interesse.Verrà calcolato il numero totale di cellule positive marcatori divise per il numero totale. Il risultato è la percentuale di cellule positive del marcatore con un nucleo o un numero di studio. Per generare dati numerici, ottenere l'intensità media di ogni marcatore di interesse in tutte le cellule studiate all'interno di un campione per estrarre il conteggio mediano normalizzato per ogni marcatore di ogni nucleo o numero di studio.Qui vengono mostrate immagini immunoistochimiche fluorescenti multiplex rappresentative per un campione diffuso di linfoma a grandi cellule B con riarrangiamento genico c-MYC e BCL2. Le immagini immunoistochimiche simulate sul campo luminoso dimostrano un simile modello di colorazione dei marcatori tumorali. L'applicazione di immagini immunoistochimiche fluorescenti multiplex a un pannello di cellule T nei linfomi angioimmunoblastici a cellule T rivela l'eterogeneità cellulare del campione tumorale.Qui vengono mostrate l'ottimizzazione di un campione di controllo delle tonsille e l'analisi dei dati risultante. Una varietà di programmi software di analisi delle immagini può essere utilizzata dopo il passaggio di unmixing per quantificare l'espressione del marcatore e la localizzazione nelle cellule tumorali e nel microambiente tumorale. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per studiare la coezione di marcatori multipli all'interno di specifici tipi cellulari in singole sezioni tissutali di linfoma.Fare attenzione a prevenire lesioni indotte dal calore durante le fasi di microwaving ed essere consapevoli dei rischi di caduta durante le fasi di scansione eseguite nel ponte.

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Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Sorveglianza della rabbia migliorata utilizzando un test immunoistochimico rapido diretto

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...