Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma at JoVE.com

S.-B.N. og A.D.J. støttes av Singapore helsedepartementets nasjonale Medical Research Council overgang Awards (NMRC/TA/0020/2013 og NMRC/TA/0052/2016). Forfatterne bekrefter et Yong Siew Yoon forskningsstipend til A.D.J. fra den National University Cancer Institute of Singapore mot kjøp av Vectra spectral tenkelig mikroskop. Denne studien er godkjent av Singapore NHG domene spesifikk gjennomgang styret B (2014/00693).

Alle vev som er brukt i denne protokollen ble innhentet under Singapore NHG domene spesifikk gjennomgang styret B studier 2014/00693.
1. valg og validering av antistoffer
Merk: Før du fortsetter med etableringen av et multiplex panel, sikre at alle antistoffer flekker robust, identifisere bare målet antigen rundt. Målet er å velge antistoffer som spesifikt gjenkjenner antigenet interesse vev deler.
<ol><li>For et antistoff med veletablerte forskningsbruk eller...

<ol>
	<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+revision+of+the+World+Health+Organization+classification+of+lymphoid+neoplasms.">The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms.</a> Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).</li><li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).</li><li>Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+for+Pathologists:+Protocols,+Pitfalls,+and+Tips.">Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+profiling+of+lymphoma.">Immunohistochemical profiling of lymphoma.</a> Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).</li><li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues.">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li><li>Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+Quantitative+Analysis+of+Protein+Expression.">Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Visualization+of+Multiple+Antigens+with+Tyramide+Signal+Amplification+using+Antibodies+from+the+same+Species.">Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Ng, S. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+a+Multiplexed+Immunofluorescence+Panel+in+T-Cell+Lymphoma.">Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma.</a> SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).</li><li>Bogusz, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+large+B-cell+lymphoma+with+concurrent+high+MYC+and+BCL2+expression+shows+evidence+of+active+B-cell+receptor+signaling+by+quantitative+immunofluorescence.">Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).</li><li>Kalyuzhny, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).</li><li>Bordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+validation.">Antibody validation.</a> BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual. , (2012).</li><li>Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+beyond+P+values:+Everyday+data+analysis+with+estimation+plots.">Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+Imaging+of+T+and+B+Cells+in+Murine+Spleen+and+Tumor.">Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor.</a> The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).</li></ol>

MF-IHC har potensial til å aktivere patologer å avgrense diagnosticcriteria i lymfoide patologi og analysere rollen biomarkers i spesifikke celletyper mot en forutsigelse av kliniske utfallet. Som en ny forskning metoden brukes mf-IHC stadig kvantitative og romlig identifikasjon av flere immun parametere tumor celler17. Gjenkjenning av mf-IHC for co uttrykket av svulst biomarkers har vist å være reproduserbare og pålitelig5. Men fortsatt teknologien begynnende og utset...

Lymfoide neoplasms skyldes ukontrollert ondartet spredning av lymfocytter. Disse cellene er avgjørende komponenter i immunsystemet og lokalisere til de primære og sekundære immun organene, som benmargen, lymfeknuter, milt og andre mucosa-assosiert lymfoid systemet. Lymfoide svulster er en heterogen gruppe lidelser som klassifiseres basert på en konstellasjon av funksjoner, inkludert morfologi, immunophenotype, særtrekk og kliniske presentasjonen. Mens hver parameter spiller en rolle, avstamning forblir et definerende trekk og danner grunnlaget for WHO klassifikasjonssystem som gjenkjenner neoplasms avledet fra B-celler og T celler naturlig killer (NK) celler1.
Nøkkelen til klassifisering av lymphoma er karakterisering av antistoffer mot leukocytter overflate markører av ulike undertypene av lymfocytter2. Immunohistochemistry (IHC) har vært tradisjonelt brukes for analyse av slike indikatorer og er basert på prinsippet om spesifikt antigen-antistoff anerkjennelse å oppdage celle - og vev-basert molekyler som kan bli visualisert gjennom lys mikroskopet 3. identifikasjon av flere mål på ett lysbilde av konvensjonelle lys-feltet kromogent multiplex IHC har imidlertid begrensninger fordi det er vanskelig å skille flere fargesignaler på en enkelt vev delen pålitelig-spesielt for antigener med en svært lav uttrykk4. Visuell vurdering og kvantifisering av flekker kan også være subjektive, forårsaker variasjon i analysen og data tolkning5.
Konvensjonelle IHC på formalin-fast, parafin-embedded (FFPE) prøver er derfor ikke mulig for samtidige påvisning av flere mål i immunologisk ulike sykdommer som lymfom. Videre er skille neoplastic lymfocytter fra omkringliggende immunceller ofte upresis. Dette hindrer studier ser på relevansen av romanen biomarkers i lymfom. I denne sammenheng multiplex fluorescerende IHC (mf-IHC) tilbyr en lovende alternativ som det tillater kvantitativ vurdering av antigen coexpression og et romlige forhold med høyere presisjon mens bevaring begrenset prøver6,7. Når denne bildeteknologi er partner med digitalt bilde analyseprogramvare, data tolkningen gjøres mer effektiv og muliggjør studiet av svulsten og microenvironment heterogenitet8,9. I denne protokollen, en tyramide-baserte immunofluorescence (hvis) multipleksing metoden brukes til å forsterke signalet og er kompatibel med noen IHC-godkjent antistoff fra alle vert Art, selv de som er utviklet i samme arter5,7 , 10. tyramide-baserte protokollen tillater direkte Bøyning av fluorophore til vev rundt slik at det primære og sekundære antistoffet kan monteres etter hvert trinn, slik at for sekvensiell anvendelse av flere flekker uten antistoff kryssreaktivitet.
En multiplex strategi vil være nyttig for utstråling prognose og behandling ved å identifisere mål og deres variant immunologic mønstre i lymfomer. Multiplex fluorescerende IHC har vært brukt i vår lab for studier av et panel av T- og B-lymfocytt markører og T-follicular hjelper markører i angioimmunoblastic T-celle lymfom (AITL), en undertype av en ekstern T-celle lymfom preget av aggressiv klinisk atferd og tumor heterogenitet11. Nytten av denne metoden er også illustrert i diffus stor B-celle lymfom (DLBCL) der den økte signalene med en B-celle reseptor med samtidige C-MYC og BCL-2 uttrykket antyder den potensielle terapeutiske bruken av Brutons tyrosin kinase hemming 12 . 
Beskriver her vi hele protokollen fra antistoff godkjenningen til valg av aktuelle kontrollen vev og multipleksing bruker lymfom FFPE vev, med en eventuell analyse av farget lysbilder ved hjelp av en skanning automatisert kvantitative patologi bildebehandling system.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>REF S3022</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>For peroxide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra multispectral automated microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Vectra2.0.8</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1135</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF822001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF812001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL6</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-MYC</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy 5</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1171</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>Graph pad</td>
			<td></td>
			<td>Statisitcal software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoClear Clearing Agent</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H2779-1L</td>
			<td>Histoclear for dewaxing and clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced 
			Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Inform Software 2.2.1</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI67</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOS MILESTONE multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone</td>
			<td></td>
			<td>Microwave for Heat induced epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>PANASONIC</td>
			<td>NN-ST651M</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>81381 Aldrich Mowiol&#174; 4-88</td>
			<td>mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1488</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal520</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1487B21</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal540</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1494</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal620</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1495</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for tissue section adhesion in routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2367</td>
			<td>For HIER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer saline (TBS)</td>
			<td>1st BASE</td>
			<td>BUF3030 20X4L</td>
			<td>for buffer wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td>Tween</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma

Immunohistochemical (IHC) metoder for på plass analyse av protein uttrykk av * lys er et kraftig verktøy for både forskning og diagnostiske formål. Men er visualisering og kvantifisering av flere antigener i et enkelt vev delen bruker konvensjonelle kromogent IHC utfordrende. Multiplex imaging er spesielt relevant i lymfom forskning og diagnostikk, der markører må tolkes i sammenheng med en kompleks svulst microenvironment. Her beskriver vi en protokoll for multiplex fluorescerende IHC flekker for å aktivere kvantitativ vurdering av flere mål i spesifikke celletyper interesse for lymfom. Metoden dekker aspekter av antistoff validering, antistoff optimalisering, multiplex optimalisering med markører av lymfom subtyper, farging av vev microarray (TMA) lysbilder og skanning av lysbildene, etterfulgt av dataanalyse, med bestemt Referanse til lymfom. Bruker denne metoden, genereres score for både bety intensiteten på en markør av interesse og prosent positivitet for å lette videre kvantitativ analyse. Multiplexing minimerer eksempel utnyttelse og gir romlig informasjon for hver indikator.

MF-IHC bilder for et DLBCL utvalg med C-MYC og BCL2 gene omorganisering (dobbel-hit lymfom) er vist i figur 1. Figur 2 viser simulert lyse-feltet immunohistochemical bilder. Figur 3 viser generasjonen av prosentandel data. Figur 4 viser detaljene for en median formel for generering av numeriske data. Figur 5 viser anvendelsen av mf-IHC av en...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma at JoVE.com

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Her beskriver vi en protokoll for multiplex fluorescerende immunohistochemical flekker og tenkelig den samtidige lokalisering av flere kreft-assosiert antigener i lymfom. Denne protokollen kan utvides til colocalization analyse av biomarkers i alle vev inndelinger.

Multiplex fluorescerende Immunohistochemical flekker, bildebehandling og analyse i histologiske prøver lymfom

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

Lymfomer er histologisk komplekse svulster. Derfor gir multipleksed fluorescerende immunohistochemistry fordeler fremfor konvensjonell kromogen immunohistokjemi for å studere markører av interesse for tumorcellene og mikromiljøet. Denne teknikken har potensial for å standardisere scoring av antistoffbasert farging i histologiske lymfomprøver, en prosess som historisk har vært utfordrende på grunn av kompleksiteten i tumormikromiljøet.Spesielt, multipleksed fluorescerende immunohistochemistry og spektral avbildning tillater kvantitativ måling av flere flekker i et enkelt lysbilde, og dermed tillater vurdering av antigen co uttrykk og spacial forhold i klinisk materiale. Begynn med å senke de-voksede og rehydrerte lysbildene i en standard antigengjenfinningsbuffer i en mikrobølgeovn spare glassburk og utføre varmeindusert epitop gjenfinning i en passende mikrobølgeovn. Utfør flere runder med mikrobølgeovn stripping basert på plasseringen av antistoffet i den endelige multiplex sekvensen.For eksempel krever det fjerde antistoffet tre ekstra runder med mikrobølgeovn stripping før farging. Etter ferdigstillelse av strippingprosessen, bruk tang og varmebestandige hansker for å overføre lysbildene til destillert vann ved romtemperatur i minst 10 minutters avkjøling. Når antigenhentingsløsningen er avkjølt, blokkerer vevperoksidaseaktiviteten med en kommersiell peroksidaseblokk i 10 minutter etterfulgt av en fem minutters vask i trisbufret saltvann, eller TBS, og et ikke-ionisk vaskemiddel.Blokker eventuelle uspesifikke flekker med en 10 minutters inkubasjon i blokkeringsbuffer etterfulgt av inkubasjon med det primære antistoffet av interesse ved romtemperatur i 30 minutter og tre fem minutters vasker med TBS-D-buffer. Deretter inkubere prøvene med en passende pepperrotperoksidase konjugert sekundært antistoff i 15 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av tre vasker i TBS-D-buffer som vist. Etter siste vask, påfør en passende tyramidbasert fluorescerende reagens på lysbildene i en fem minutters inkubasjon ved romtemperatur etterfulgt av tre fem minutters TBS-D vasker.Utfør en ekstra mikrobølgebasert stripping for å fjerne de primære og sekundære antistoffene i fersk antigenhentingsløsning som vist. På slutten av gjenfinningen avkjøles lysbildene i destillert vann og tørker områdene på lysbildene uten vev med laboratorieservietter. Inkubersklie med dappy i 10 minutter ved romtemperatur etterfulgt av tre TBS-D vasker.Tørk deretter forsiktig lysbildene med laboratorieservietter uten å kontakte vevet og montere prøvene med et passende monteringsmedium for avbildning. For monoplex slide scanning, velg de riktige filtrene fra fluoroforene som brukes til å merke prøvene og undersøke hver markør og dens tilsvarende fluorescenskanal for å identifisere en passende eksponeringstid for å oppnå et rent signal, med fokus på vevskomponenten som skal ha det sterkeste signalet for markøren. Hvis du vil tillate sammenligning av pikselintensiteten på tvers av prøven, bruker du innstillingen for direkte kamera til å justere eksponeringstiden i hver enkelt kanal til det ikke er overeksponerte områder i det direktesendte kamerabildet.Når alle lysbildene er skannet, kan du skaffe simulerte lyse feltbilder for å visuelt sammenligne med det normale immunohistokjemiske mønsteret og for å finne ut om fargemønsteret er riktig. For å skanne vevmikroarraylysbilder, bruk vevmikroarrayskanningsmodusen i bildesystemet og en passende autofokusalgoritme. For hele vevsseksjonen glir, få lysbildene gjennomgått av en kvalifisert patolog for å velge optimale bilder fra de mest representative tumorområdene.Før du begynner analysen, velg en tumormarkør for å identifisere cellene av interesse for analysen. Be en patolog gjennomgå bildene og avgjøre om vevssegmentering er nødvendig. Velg om nødvendig de riktige kontrollområdene for segmentering og kontroller om bildeanalyseprogramvaren kan identifisere slike områder på riktig måte.Etter cellesegmenteringen, be patologen gjennomgå segmenteringskartet for å sikre troskap av den tiltenkte segmenteringstilnærmingen og gjennomgå individuelle bilder for å avgjøre om cellesegmenteringen er tilstrekkelig, eller om ytterligere vevsegmentering er nødvendig for å velge regioner beriket for tumorceller, stroma og eller nekrose. Deretter bestemmer den optiske intensiteten positiv cutoff verdi for hver markør i forbindelse med patologen og generere histogrammer i et passende statistikkprogram for å analysere frekvensfordelingen av markørintensiteten per celle. Hvis du vil generere prosentvise data for bestemte interessemarkører i definerte celler, setter du inn en pivottabell i dataarket og velger Sum for å beregne positivitetsprosenten for én enkelt interessemarkør.Totalt antall markørpositive celler delt på det totale antallet beregnes. Resultatet er markøren positiv celleprosent med en kjerne, eller ett studienummer. For å generere numeriske data, få gjennomsnittlig intensitet av hver markør av interesse i alle cellene studien i en prøve for å trekke ut median normalisert antall for hver markør for hver kjerne eller studienummer.Her vises representative multipleks fluorescerende immunohistokjemiske bilder for en diffus stor B-cellelymfomprøve med c-MYC og BCL2 genomarrangement. Simulerte lyse feltimmunohistokjemiske bilder viser et lignende tumormarkørfargingsmønster. Anvendelsen av multipleks fluorescerende immunohistokjemiske bilder til et T-cellepanel i angioimmunoblastiske T-cellelymfomer avslører celle heterogeniteten til tumorprøven.Her vises optimaliseringen av et mandlenekontrollutvalg og den resulterende dataanalysen. En rekke bildeanalyseprogrammer kan brukes etter det ubysende trinnet for å kvante markøruttrykk og lokalisering i tumorceller og tumormikromiljøet. Denne teknikken baner vei for forskere å studere co uttrykk for flere markører innenfor bestemte celletyper i enkeltvev seksjoner av lymfom.Pass på å forhindre varmeindusert skade under mikrobølgetrinnene og vær oppmerksom på fallrisiko under skannetrinnene som utføres på dekk.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Multiplex Påvisning av bakterier i Complex Clinical and Environmental Prøver å bruke oligonukleotid-coupled Fluorescent Mikrokuler

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Fluorescens Optisk Imaging av Inflammatorisk MMP Aktivitet ved hjelp av en aktiverbar fluorescerende Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Meget multiplexert, superoppløselig bildebehandling av T-celler ved hjelp av madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Utnyttelse av kapsler for negativ farging av virale prøver innen biokonduksjon

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

Histologiske kvantifisering å bestemme lunge Fungal byrden på eksperimentell aspergillose

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

Bruker Robotic systemer til å behandle og legge Colonic Murine prøver for histologiske analyser

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Forsterket rabiat overvåking benytter en direkte rask Immunhistokjemiske test

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...