Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00
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S.-B.N. e A.D.J. são suportados pelo Medical Research Conselho transição prêmios do Ministério da saúde a Singapore nacionais (NMRC/TA/0020/2013 e NMRC/TA/0052/2016). Os autores reconhecem uma bolsa de investigação de Yoon Siew Yong para A.D.J. partir da Universidade Nacional Cancer Institute de Cingapura para a compra de um microscópio de imagem espectral de Vectra. Este estudo é aprovado pela B Singapore NHG domínio específico Review Board (2014/00693).

Todos os tecidos utilizados neste protocolo foram obtidos sob o B Singapore NHG domínio específico Review Board estudar 00693/2014.
1. seleção e validação de anticorpos
Nota: Antes de prosseguir com a criação de qualquer painel multiplexada, certifique-se que todos os anticorpos mancham robustamente, identificando apenas o antígeno alvo de interesse. O objectivo é seleccionar os anticorpos que reconhecem especificamente o antígeno de interesse em secções ...

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MF-IHC tem o potencial para permitir que os patologistas para refinar diagnosticcriteria em patologia linfoide e analisar o papel dos biomarcadores em tipos de células específicas em direção a uma previsão de resultados clínicos. Como um novo método de investigação, mf-IHC é cada vez mais aplicado à identificação de vários parâmetros imunes de células de tumor17quantitativa e espacial. A detecção de mf-IHC para a expressão co de biomarcadores de tumor mostrou ser confiável e re...

Neoplasias linfoides são causadas pela proliferação descontrolada de linfócitos maligna. Estas células são componentes vitais do sistema imunológico e localizar nos órgãos imunes primárias e secundárias, tais como a medula óssea, linfonodos, baço e outro sistema linfoide associado a mucosa. Neoplasias linfoides são um grupo heterogêneo de desordens que são classificados com base em uma constelação de características, incluindo morfologia, imunofenótipo, apresentação clínica e características genéticas. Enquanto cada parâmetro desempenha um papel, linhagem continua a ser uma característica definidora e constitui a base para o sistema de classificação do WHO que reconhece neoplasias derivadas de células B, células T e natural killer (NK) células1.
Chave para a classificação de linfoma foi a caracterização dos anticorpos contra marcadores de superfície dos leucócitos dos vários subtipos de linfócitos2. Imuno-histoquímica (IHC) tem sido tradicionalmente utilizado para a análise de tais marcadores e baseia-se no princípio do reconhecimento do antígeno-anticorpo específico para detectar moléculas baseadas em células e tecidos que podem ser visualizadas através do microscópio de luz 3. no entanto, a identificação de alvos múltiplos em um único slide por convencional brilhante-campo cromogênico multiplex IHC tem limitações porque muitas vezes é difícil distinguir vários sinais de cor em uma seção de tecido único confiável — especialmente para os antígenos com uma expressão muito baixo4. Avaliação visual e quantificação de coloração também podem ser subjetivas, causando a variabilidade na interpretação de dados e análise5.
Portanto, IHC convencional em amostras de formalin-fixas, parafina (FFPE) não é viável para a detecção simultânea de múltiplos alvos em imunologicamente diversas doenças como o linfoma. Além disso, distinguir linfócitos neoplásicos das células imunes circundantes é muitas vezes imprecisa. Isto dificulta estudos olhando a relevância de novos biomarcadores em linfoma. Neste contexto, IHC fluorescente multiplex (mf-IHC) oferece uma alternativa promissora como permite a avaliação quantitativa coexpression antígeno e uma relação espacial com maior precisão, preservando a limitada amostras6,7. Quando esta tecnologia de imagem é uma parceria com o software de análise de imagem digital, a interpretação dos dados é feita mais eficiente e facilita o estudo de tumor e microambiente heterogeneidade8,9. Neste protocolo, a imunofluorescência baseada em tyramide (IF) multiplexação método é aplicada para amplificar o sinal e é compatível com qualquer anticorpo IHC validados de qualquer espécie de hospedeiro, mesmo aqueles desenvolvidos na mesma espécie5,7 , 10. o protocolo baseado em tyramide permite a conjugação direta do fluoróforo no tecido de interesse para que o anticorpo primário e secundário pode ser desnudado após cada etapa, permitindo a aplicação sequencial de múltiplas manchas sem reactividade cruzada do anticorpo.
Uma estratégia multiplexada será útil para prever resultados de prognóstico e tratamento através da identificação de alvos e seus padrões variante imunológicas em linfomas. Multiplex fluorescente IHC tem sido aplicado em nosso laboratório para o estudo de um painel de marcadores de T e de linfócitos B e T-folicular marcadores de auxiliar em angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), um subtipo de um linfoma de células T periférico caracterizada por agressivo clínico comportamento e tumor heterogeneidade11. A utilidade desse método é também ilustrada em difusa linfoma de células B grande (DLBCL), onde o aumento de sinalização de um receptor de células B com expressão de C-MYC e BCL-2 simultânea sugere o uso terapêutico potencial de inibição de quinase de tirosina de Bruton 12 . 
Aqui descrevemos o protocolo inteiro da validação de anticorpo para a seleção dos tecidos de controle apropriado e multiplexação usando linfoma FFPE tecidos, com uma eventual análise das lâminas coradas usando uma varredura automatizada de imagem patologia quantitativa sistema.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>REF S3022</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>For peroxide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra multispectral automated microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Vectra2.0.8</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1135</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF822001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF812001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL6</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-MYC</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy 5</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1171</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>Graph pad</td>
			<td></td>
			<td>Statisitcal software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoClear Clearing Agent</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H2779-1L</td>
			<td>Histoclear for dewaxing and clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced 
			Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Inform Software 2.2.1</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI67</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOS MILESTONE multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone</td>
			<td></td>
			<td>Microwave for Heat induced epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>PANASONIC</td>
			<td>NN-ST651M</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>81381 Aldrich Mowiol&#174; 4-88</td>
			<td>mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1488</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal520</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1487B21</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal540</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1494</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal620</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1495</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for tissue section adhesion in routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2367</td>
			<td>For HIER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer saline (TBS)</td>
			<td>1st BASE</td>
			<td>BUF3030 20X4L</td>
			<td>for buffer wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td>Tween</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma

Métodos de imuno-histoquímica (IHC) para a análise in situ da expressão da proteína por microscopia de luz são uma ferramenta poderosa para fins de diagnóstico e pesquisa. No entanto, a visualização e a quantificação de vários antígenos em uma seção de tecido único usando IHC cromogênico convencional é um desafio. Imagem multiplexada é especialmente relevante na investigação de linfoma e diagnósticos, onde marcadores tem que ser interpretada no contexto de um microambiente do tumor complexo. Aqui descrevemos um protocolo para multiplexado IHC fluorescente coloração para permitir a avaliação quantitativa de alvos múltiplos em tipos de células específicas de interesse do linfoma. O método abrange os aspectos de validação de anticorpo, otimização de anticorpo, a otimização multiplex com marcadores de subtipos de linfoma, a coloração de lâminas de tecido microarray (TMA) e a digitalização de slides, seguido de análise de dados, com específicas referência para o linfoma. Usando esse método, partituras para ambos a intensidade média de um marcador de interesse e a percentagem de positividade são geradas para facilitar ainda mais a análise quantitativa. Multiplexação minimiza a utilização da amostra e fornece informação espacial para cada marcador de interesse.

MF-IHC imagens para uma amostra DLBCL com C-MYC e rearranjo de gene BCL2 (dobro-bata linfoma) são mostradas na Figura 1. A Figura 2 ilustra as imagens simulada brilhante-campo imuno-histoquímica. Figura 3 indica a geração de dados de porcentagem. Figura 4 exibe os detalhes de uma fórmula mediano para a geração de dados numéricos. A Figura 5</...

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Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Aqui descrevemos um protocolo para multiplex immunohistochemical fluorescente de coloração e de imagem para localização simultânea de múltiplos antígenos associada a câncer de linfoma. Este protocolo pode ser estendido para a análise de colocalization de biomarcadores dentro de todas as secções de tecido.

Coloração imuno-histoquímica fluorescente multiplexada, imagem e análise de amostras histológicas de linfoma

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

Linfomas são tumores histologicamente complexos. Portanto, a imunohistoquímica fluorescente multiplexada oferece vantagens sobre a imunohistoquímica cromogênica convencional para estudar marcadores de interesse nas células tumorais e no microambiente. Essa técnica tem o potencial de padronizar a pontuação de manchas à base de anticorpos em amostras de linfoma histológico, processo historicamente desafiador devido à complexidade do microambiente tumoral.Especificamente, a imunohistoquímica fluorescente multiplexada e a imagem espectral permitem a medição quantitativa de múltiplas manchas dentro de um único slide, permitindo assim a avaliação da co expressão do antígeno e da relação espacial dentro do material clínico. Comece imergindo os slides depilados e rehidratados em um tampão de recuperação de antígeno padrão em um frasco de vidro de micro-ondas e realizando recuperação de epítope induzida pelo calor em um micro-ondas adequado. Realize rodadas adicionais de descascamento de micro-ondas com base na posição do anticorpo na sequência multiplex final.Por exemplo, o quarto anticorpo requer três rodadas adicionais de descascamento de micro-ondas antes da coloração. Após a conclusão do processo de descascamento, use fórceps e luvas à prova de calor para transferir os slides para água destilada em temperatura ambiente por pelo menos 10 minutos. Quando a solução de recuperação de antígeno tiver esfriado, bloqueie a atividade de peroxidase tecidual com um bloco comercial de peroxidase por 10 minutos seguido de uma lavagem de cinco minutos em soro fisiológico tris-tampão, ou TBS, e um detergente não iônico.Bloqueie qualquer coloração inespecífica com uma incubação de 10 minutos no buffer de bloqueio seguido de incubação com o anticorpo primário de interesse à temperatura ambiente por 30 minutos e três lavagens de cinco minutos com tampão TBS-D. Em seguida, incubar as amostras com um anticorpo secundário conjugado de rabanete apropriado por 15 minutos à temperatura ambiente, seguido por três lavagens em tampão TBS-D, como demonstrado. Após a última lavagem, aplique um reagente fluorescente à base de tirado apropriado nos slides para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, seguido por três lavagens TBS-D de cinco minutos.Realize uma desmontagem adicional baseada em micro-ondas para remover os anticorpos primários e secundários em uma solução de recuperação de antígeno fresco, conforme demonstrado. No final da recuperação, esfrie os slides em água destilada e seque as áreas nas lâminas sem tecido com lenços de laboratório. Incubar slide com dappy por 10 minutos à temperatura ambiente seguido de três lavagens TBS-D.Em seguida, seque cuidadosamente as lâminas com lenços de laboratório sem entrar em contato com os tecidos e monte as amostras com um meio de montagem apropriado para a imagem. Para a varredura de slides monoplex, selecione os filtros apropriados dos fluoroforos utilizados para rotular as amostras e examinar cada marcador e seu canal de fluorescência correspondente para identificar um tempo adequado de exposição para a obtenção de um sinal limpo, focando no componente tecidual que deve ter o sinal mais forte para o marcador. Para permitir a comparação entre amostras da intensidade do pixel, use a configuração da câmera ao vivo para ajustar o tempo de exposição em cada canal individual até que não haja áreas superexpostas na imagem da câmera ao vivo.Quando todos os slides tiverem sido escaneados, adquira imagens simuladas de campo brilhante para comparar visualmente com o padrão imunohistoquímico normal e determinar se o padrão de coloração está correto. Para digitalizar slides de microarray tecidual, use o modo de varredura de microarray tecidual no sistema de imagem e um algoritmo de foco automático apropriado. Para lâminas de seção de tecido inteiro, tenha os slides revisados por um patologista qualificado para selecionar imagens ideais das áreas tumorais mais representativas.Antes de iniciar a análise, selecione um marcador tumoral para identificar as células de interesse para a análise. Consulte o patologista para revisar as imagens e decidir se a segmentação tecidual é necessária. Se necessário, selecione as regiões de controle apropriadas para segmentação e verifique se o software de análise de imagens pode identificar corretamente tais regiões.Após a segmentação celular, o patologista revise o mapa de segmentação para garantir a fidelidade da abordagem de segmentação pretendida e revise imagens individuais para determinar se a segmentação celular é adequada ou se a segmentação adicional de tecidos é necessária para selecionar regiões enriquecidas para células tumorais, estroma e ou necrose. Em seguida, determine o valor de corte positivo de intensidade óptica para cada marcador em conjunto com o patologista e gere histogramas em um programa de software estatístico apropriado para analisar a distribuição de frequência da intensidade do marcador por célula. Para gerar dados percentuais para marcadores específicos de interesse dentro de células definidas, insira uma tabela pivô na folha de dados e selecione Sum para calcular a porcentagem de positividade de um único marcador de interesse.O número total de células positivas de marcadores divididas pelo número total será calculado. O resultado é a porcentagem de células positivas marcadores com um núcleo, ou um número de estudo. Para gerar dados numéricos, obtenha a intensidade média de cada marcador de interesse em todas as células estudadas dentro de uma amostra para extrair a contagem mediana normalizada para cada marcador de cada núcleo ou número de estudo.Aqui, são mostradas imagens imunohistoquímicas fluorescentes multiplex representativas para uma amostra difusa de linfoma de células B com rearranjo genético c-MYC e BCL2. Imagens imunohistoquímicas de campo brilhante simuladas demonstram um padrão de coloração de marcador tumoral semelhante. A aplicação de imagens imunohistoquímicas fluorescentes multiplex a um painel de células T em linfomas angioimunoblásticos de células T revela a heterogeneidade celular da amostra do tumor.Aqui, mostra-se a otimização de uma amostra de controle de amígdalas e a análise de dados resultante. Uma variedade de programas de software de análise de imagem pode ser usada após o passo descompra para quantificar a expressão e localização do marcador em células tumorais e no microambiente tumoral. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores estudarem a coexpressão de múltiplos marcadores dentro de tipos de células específicas em seções de linfoma de tecidos únicos.Tome cuidado para evitar lesões induzidas pelo calor durante as etapas de micro-ondas e esteja ciente dos riscos de queda durante as etapas de varredura que são realizadas no deck.

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