Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma at JoVE.com

Министерство здравоохранения Сингапура национальных медицинских исследований Совета переходного периода награды (NMRC/TA/0020/2013 и NMRC/TA/0052/2016) поддерживаются S.-б.н. и A.D.J.. Авторы признают Сью Ен Юн исследовательский грант A.D.J. из Национального института университета рака Сингапура к покупке спектральных тепловизионных микроскопом Vectra. Это исследование одобрено Сингапур NHG домена конкретного обзора Совет B (2014/00693).

Все ткани, используемые в настоящем протоколе были получены под Сингапур NHG домена конкретного обзора Совет B изучение 2014/00693.
1. отбор и проверка антител
Примечание: Прежде чем продолжить создание любой мультиплексированных группы, убедитесь, что все антите?...

<ol>
	<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+revision+of+the+World+Health+Organization+classification+of+lymphoid+neoplasms.">The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms.</a> Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).</li><li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).</li><li>Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+for+Pathologists:+Protocols,+Pitfalls,+and+Tips.">Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+profiling+of+lymphoma.">Immunohistochemical profiling of lymphoma.</a> Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).</li><li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues.">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li><li>Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+Quantitative+Analysis+of+Protein+Expression.">Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Visualization+of+Multiple+Antigens+with+Tyramide+Signal+Amplification+using+Antibodies+from+the+same+Species.">Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Ng, S. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+a+Multiplexed+Immunofluorescence+Panel+in+T-Cell+Lymphoma.">Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma.</a> SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).</li><li>Bogusz, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+large+B-cell+lymphoma+with+concurrent+high+MYC+and+BCL2+expression+shows+evidence+of+active+B-cell+receptor+signaling+by+quantitative+immunofluorescence.">Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).</li><li>Kalyuzhny, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).</li><li>Bordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+validation.">Antibody validation.</a> BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual. , (2012).</li><li>Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+beyond+P+values:+Everyday+data+analysis+with+estimation+plots.">Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+Imaging+of+T+and+B+Cells+in+Murine+Spleen+and+Tumor.">Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor.</a> The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).</li></ol>

MF-IHC имеет потенциал для включения патологоанатомов для уточнения diagnosticcriteria в лимфоидных патологии и анализировать роль биомаркеров в типах конкретных клеток к предсказание клинических исходов. Как новый метод исследования mf-IHC все чаще применяется для количественного и пространстве...

Новообразования лимфоидной, вызванных бесконтрольного распространения злокачественного лимфоцитов. Эти клетки являются жизненно важными компонентами иммунной системы и локализации первичного и вторичного иммунных органов, например костного мозга, лимфатические узлы, селезенка и другие слизистой оболочки ассоциированной лимфоидной системы. Лимфоидных образований являются гетерогенной группы расстройств, которые классифицируются на основании созвездие функций, включая морфологии, иммунофенотип, генетические особенности и клинической картины. Хотя каждый параметр играет роль, линии остается определяющей чертой и формирует основу для системы классификации ВОЗ, которая признает новообразования, производные от клетки B, Т-клеток и естественных убийца (НК) клетки1.
Ключ к классификации лимфомы была характеристика антител против лейкоцита поверхностных маркеров различных подтипов лимфоцитов2. Иммуногистохимия (IHC) традиционно используется для анализа таких маркеров и основывается на принципе признания конкретных антиген антитело для обнаружения на основе клеток и тканей молекул, которые могут быть визуализированы через световой микроскоп 3. Однако, выявление нескольких целевых объектов на одном слайде, обычных ярко поле хромогенных мультиплекс IHC имеет ограничения, потому что это часто трудно отличить несколько сигналов цвет на участке одной ткани надежно — особенно для антигенов с очень низким выражение4. Также может быть субъективным, вызывая изменчивость в интерпретации анализа и данных5визуальной оценки и количественного определения окраски.
Таким образом обычные IHC на формалин исправлена, парафин врезанных образцов (FFPE) возможна не для одновременного обнаружения нескольких целей в иммунологически разнообразных заболеваний, как лимфома. Кроме того отличительный неопластических лимфоцитов из окружающих иммунные клетки часто является неточным. Это препятствует исследований, глядя на актуальность Роман биомаркеров в лимфомы. В этом контексте, мультиплекс флуоресцентные IHC (mf-IHC) предлагает перспективные альтернативы как позволяет количественной оценки ИССЛЕДОВАНИџ антигена и пространственные отношения с более высокой точностью при сохранении ограниченный образцы6,7. При этой технологии визуализации в партнерстве с программное обеспечение для анализа цифровых изображений, интерпретации данных производится более эффективным и облегчает исследование опухоли и микроокружения неоднородность8,9. В этом протоколе на основе tyramide иммунофлюоресценции (если) мультиплексирования метод применяется для усиления сигнала и совместим с любой ИГХ проверены антитела от любых видов хост, даже тех, которые разработаны в том же видов5,7 , 10. протокол на основе tyramide позволяет для прямого спряжение Флюорофор в ткани интерес так, что после каждого шага, позволяя для последовательного применения нескольких пятен могут быть лишены первичного и вторичного антитела без антитела перекрестной реактивности.
Мультиплексированных стратегия будет полезной для прогнозирования прогноз и лечение результатов путем определения целей и их вариант иммунологические закономерности в лимфом. Мультиплекс люминесцентные IHC был применен в нашей лаборатории для изучения группы маркеры лимфоцитов B и T и T-фолликулярная вспомогательные маркеры в angioimmunoblastic Т-клеточная лимфома (AITL), подтип периферической Т-клеточной лимфомы характеризуется агрессивным клинических поведение и опухоли неоднородность11. Полезность этого метода также иллюстрируется диффузный большой B-клеточной лимфомы (ККЛ), где увеличилась сигнализации B-клеточный рецептор с одновременным BCL-2 и C-MYC выражение предполагает потенциал терапевтического использования Брутон ингибирование киназы тирозина 12 . 
Здесь мы описываем весь протокол от проверки антитела к выбору соответствующего управления тканей и мультиплексирование с помощью лимфома FFPE ткани, с возможного анализа окрашенных слайдов с помощью сканирования автоматизированных количественные патологии изображений системы.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>REF S3022</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>For peroxide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra multispectral automated microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Vectra2.0.8</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1135</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF822001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF812001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL6</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-MYC</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy 5</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1171</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>Graph pad</td>
			<td></td>
			<td>Statisitcal software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoClear Clearing Agent</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H2779-1L</td>
			<td>Histoclear for dewaxing and clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced 
			Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Inform Software 2.2.1</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI67</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOS MILESTONE multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone</td>
			<td></td>
			<td>Microwave for Heat induced epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>PANASONIC</td>
			<td>NN-ST651M</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>81381 Aldrich Mowiol&#174; 4-88</td>
			<td>mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1488</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal520</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1487B21</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal540</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1494</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal620</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1495</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for tissue section adhesion in routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2367</td>
			<td>For HIER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer saline (TBS)</td>
			<td>1st BASE</td>
			<td>BUF3030 20X4L</td>
			<td>for buffer wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td>Tween</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma

Иммуногистохимический (IHC) методы для in situ анализ выражения протеина, световой микроскопии являются мощным инструментом для исследовательских и диагностических целей. Однако визуализации и количественной оценки нескольких антигенов в разделе одной ткани с помощью обычных хромогенных IHC является сложной задачей. Мультиплексированных изображений является особенно актуальным в лимфома исследований и диагностики, где маркеры должны толковаться в контексте сложных опухоли микроокружения. Здесь мы описываем протокол для мультиплексных флуоресцентные IHC пятнать возможность количественной оценки несколько целевых объектов, в типах конкретных клеток интереса к лимфомы. Метод охватывает аспекты проверки антитела, антитела оптимизации, мультиплекс оптимизации с маркерами лимфомы подтипы, окрашивание ткани microarray (TMA) слайдов, и сканирование слайдов, а затем анализа данных, с конкретными Ссылка для лимфомы. С помощью этого метода, ноты для средней интенсивности маркером интерес и процент позитивность создаются для облегчения дальнейшего количественного анализа. Мультиплексирование минимизирует образец использования и обеспечивает пространственной информации, представляющей интерес для каждого маркера.

MF-IHC изображения для ККЛ образца с C-MYC и BCL2 гена перестановка (двойной хит лимфомы) показано на рисунке 1. Рисунок 2 иллюстрирует имитируемых ярко поле иммуногистохимические изображений. Рисунок 3 показывает процент данны?...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma at JoVE.com

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Здесь мы описываем протокол для мультиплекс флуоресцентные иммуногистохимическое окрашивание и изображений для одновременного локализации нескольких связанных рака антигенов в лимфомы. Этот протокол может быть продлен на colocalization анализ биомаркеров в всех разделах ткани.

Мультиплексированных флуоресцентные иммуногистохимическое окрашивание, визуализации и анализа в гистологической образцы лимфомы

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

Лимфомы являются гисто логически сложными опухолями. Таким образом, мультиплексный флуоресцентный иммуногистохимия предлагает преимущества по сравнению с обычной хромогенной иммуногистохимией для изучения маркеров интереса к опухолевым клеткам и микроокноронии. Этот метод имеет потенциал для стандартизации скоринга антител на основе окрашивания в гистологических образцов лимфомы, процесс, который исторически был сложным из-за сложности микроокноронирования опухоли.В частности, мультиплексированная флуоресцентная иммуногистохимия и спектральная визуализация позволяют количественно измерять множественные пятна в пределах одного слайда, тем самым позволяя оценить совместное выражение антигена и спациальные отношения внутри клинического материала. Начните с погружения де-восковых и регидратированных слайдов в стандартный буфер поиска антигена в микроволновой печи сохранить стеклянную банку и выполнения тепловых эпитоп поиска в подходящей микроволновой печи. Выполните дополнительные раунды зачистки микроволновой печи в зависимости от положения антитела в окончательной последовательности мультиплекса.Например, четвертое антитело требует трех дополнительных раундов микроволновой зачистки до окрашивания. После завершения процесса зачистки, используйте типсы и теплостойкие перчатки для передачи слайдов в дистиллированной воде при комнатной температуре, по крайней мере 10 минут остыть. Когда раствор поиска антигена остынет, блокируйте активность пероксидазы тканей коммерческим блоком пероксидаса в течение 10 минут, а затем пятиминутной стиркой в трис-буферном солевом растворе, или TBS, и неионной моющее средство.Блокируйте любое неспецифическое окрашивание 10-минутной инкубацией в блокирующий буфер с последующим инкубацией с первичным антителом интереса при комнатной температуре в течение 30 минут и три пятиминутные промывания буфером TBS-D. Затем инкубировать образцы с соответствующим пероксидасом хрена спрягается вторичное антитело в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем три моет в буфер TBS-D, как попродемонстрировано. После последней стирки нанесите на слайды соответствующий тирамид на основе флуоресцентного реагента в течение пяти минут инкубации при комнатной температуре с последующим тремя пятиминутными промывки TBS-D.Выполните дополнительную зачистку на основе микроволновой печи, чтобы удалить первичные и вторичные антитела в свежем растворе поиска антигена, как попродемонстрировано. В конце поиска, охладить слайды в дистиллированной воде и высушить области на слайдах без ткани с лабораторными салфетками. Инкубировать слайд с dappy в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем три TBS-D моет.Затем тщательно высушите слайды лабораторными салфетками, не контактируете с тканями и смонтировать образцы с соответствующей монтажной средой для визуализации. Для моноплексного сканирования слайдов выберите соответствующие фильтры из флюорофоров, используемых для маркировки образцов, и изучите каждый маркер и соответствующий канал флуоресценции, чтобы определить подходящее время экспозиции для получения чистого сигнала, сосредоточив внимание на компоненте ткани, который должен иметь самый сильный сигнал для маркера. Чтобы продать перекрестную сравнение интенсивности пикселей, используйте настройку живой камеры, чтобы отрегулировать время экспозиции в каждом отдельном канале до тех пор, пока в изображении живой камеры не будет переэкспонированных областей.Когда все слайды были отсканированы, приобрести смоделированные яркие изображения поля, чтобы визуально сравнить с нормальным иммуноистохимическим рисунком и определить, правильно ли окрашивание. Для сканирования микроаррейных слайдов тканей используйте режим сканирования микроаррей тканей в системе визуализации и соответствующий алгоритм автофокусировки. Для слайдов раздела целых тканей, есть слайды рассмотрены квалифицированным патологоанатомом, чтобы выбрать оптимальные изображения из наиболее репрезентативных областей опухоли.Перед началом анализа выберите маркер опухоли для выявления клеток, представляющих интерес для анализа. У патологоанатома обзор изображений и решить, является ли сегментация тканей не требуется. При необходимости выберите соответствующие регионы управления для сегментации и проверьте, может ли программное обеспечение для анализа изображений правильно идентифицировать такие регионы.После сегментации клеток, иметь патологоанатом обзор карты сегментации для обеспечения верности предполагаемого подхода сегментации и обзор отдельных изображений, чтобы определить, является ли сегментация клеток является адекватной или если дополнительные сегментации тканей требуется для выбора регионов, обогащенных для опухолевых клеток, стромы и или некроза. Затем определите оптическое значение интенсивности положительного отсечения для каждого маркера в сочетании с патологоанатомом и создать гистограммы в соответствующей программе программного обеспечения статистики для анализа частотного распределения интенсивности маркера на клетку. Для генерации процентных данных для конкретных маркеров, представляющих интерес в определенных ячейках, вставьте таблицу разворота в таблицу данных и выберите Sum для расчета положительного процента одного маркера интереса.Будет рассчитано общее количество маркерных положительных ячеек, разделенных на общее число. Результатом является маркер положительный процент клеток с одним ядром, или один номер исследования. Для генерации числовых данных, получить среднюю интенсивность каждого маркера интереса во всех клетках исследования в выборке для извлечения медианного нормализованного числа для каждого маркера каждого ядра или исследования числа.Здесь показаны репрезентативные мультиплексные флуоресцентные иммуногистохимические изображения для диффузного большого образца В-клеточной лимфомы с перестановкой генов c-MYC и BCL2. Смоделированные яркие иммуногистохимические изображения поля демонстрируют аналогичную модель окрашивания маркера опухоли. Применение мультиплексных флуоресцентных иммуногистохимических изображений к Т-клеточной панели при ангиоиммунобласти Т-клеточных лимфом выявляет неоднородность клеточного образца опухоли.Здесь показана оптимизация образца контроля миндалин и полученный анализ данных. Различные программы анализа изображений могут быть использованы после несмешного шага для количественного выражения маркера и локализации опухолевых клеток и микрооквидения опухоли. Этот метод прокладывает путь для исследователей, чтобы изучить совместное выражение нескольких маркеров в конкретных типах клеток в отдельных тканях разделов лимфомы.Позаботьтесь, чтобы предотвратить тепловые травмы во время микроволновых шагов и быть в курсе рисков падения во время сканирования шаги, которые выполняются в палубе.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Вывод тимуса лимфомы Т-клеточных линий из Atm - / -</sup И Р53 - / -</sup Мыши

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Использование флуоресцентных Иммуно-химия для обнаружения Edwardsiella ictaluri В канале сома ( I. punctatus) Образцов

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Мультиплекс Обнаружение бактерий в сложных клинических и экологических пробах с использованием олигонуклеотидных связью Флуоресцентные Микросферы

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Неинвазивная<em&gt; In Vivo</em&gt; Флуоресцентная оптическая визуализация воспалительной активности ММП с использованием активируемого флуоресцентного средства визуализации

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Высоко мультиплексированная, высокоразрешающая визуализация т-клеток с использованием madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Использование капсул для отрицательного окрашивания вирусных образцов в области биологического обогащения

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

Гистологические количественная оценка для определения в экспериментальной аспергиллез легких грибковых бремя

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

С помощью роботизированных систем для обработки и внедрить толстой мышиных проб для гистологического анализа

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Улучшенное наблюдение за бешенством с помощью прямого быстрого иммуногистохимического теста

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...