Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00
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S.-B.N. y A.D.J. son apoyados por el médicos investigación Consejo transición premios de Ministerio de salud Singapur nacionales (NMRC/TA/0020/2013 y NMRC/TA/0052/2016). Los autores reconocen una beca de investigación Yoon Yong Siew a A.D.J. de la Universidad Nacional cáncer Institute de Singapur hacia la compra de un microscopio de proyección de imagen espectral de Vectra. Este estudio es aprobado por el Singapur NHG dominio específico de Junta B (2014/00693).

Todos los tejidos utilizados en este protocolo se obtuvieron bajo el B Singapur NHG dominio específico de tablero de estudio 2014/00693.
1. selección y validación de los anticuerpos
Nota: Antes de proceder con el establecimiento de cualquier panel multiplexado, asegúrese de que todos los anticuerpos de la mancha enérgicamente, identificar sólo el antígeno blanco de interés. El objetivo es seleccionar anticuerpos que reconocen específicamente el antígeno de i...

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MF-IHC tiene el potencial para permitir que los patólogos perfeccionando diagnosticcriteria en patología linfoide y analizar el papel de los biomarcadores en tipos específicos de la célula hacia una predicción del resultado clínico. Como un nuevo método de investigación, mf-IHC se aplica cada vez más a la identificación cuantitativa y espacial de múltiples parámetros inmunes de las células de tumor17. La detección de mf-IHC de la coexpresión de marcadores biológicos de tumor ha dem...

Neoplasias linfoides son causados por la incontrolada proliferación maligna de linfocitos. Estas células son componentes vitales del sistema inmune y localización a los órganos inmunes primarios y secundarios, como la médula ósea, ganglios linfáticos, bazo y otros sistema linfoide asociado a mucosa. Neoplasias linfoides son un grupo heterogéneo de trastornos que se clasifican basados en una constelación de características, incluyendo la morfología, immunophenotype, características genéticas y la presentación clínica. Mientras que cada parámetro desempeña un papel, sigue siendo una característica que define y constituye la base para el sistema de clasificación de la OMS que reconoce neoplasias derivadas de células B, células T y natural killer (NK) las células1.
Clave para la clasificación del linfoma ha sido la caracterización de los anticuerpos contra marcadores de superficie de leucocitos de los diversos subtipos de linfocitos2. Inmunohistoquímica (IHQ) se ha utilizado tradicionalmente para el análisis de estos marcadores y se basa en el principio del reconocimiento antígeno-anticuerpo específico para detectar moléculas basado en células y tejidos que pueden visualizarse con el microscopio de luz 3. sin embargo, la identificación de objetivos múltiples en una sola diapositiva por IHC multiplex cromogénico convencional de campo brillante tiene limitaciones porque a menudo es difícil distinguir múltiples señales de color en una sección de tejido único fiable — especialmente para los antígenos con una expresión muy baja de4. Evaluación visual y cuantificación de la coloración también pueden ser subjetivas, provocando variabilidad en la interpretación de datos y análisis5.
Por lo tanto, IHC convencional en las muestras (FFPE) formalina-fijos, parafina-encajado no es factible para la detección simultánea de múltiples objetivos en contra diversas enfermedades como el linfoma. Por otra parte, distinguir los linfocitos neoplásticos de las células inmunes circundantes es a menudo imprecisa. Esto impide estudios que la relevancia de nuevos biomarcadores en el linfoma. En este contexto, IHC fluorescente multiplex (mf-IHC) ofrece una alternativa prometedora que permite la evaluación cuantitativa de coexpression de antígeno y una relación espacial con mayor precisión mientras que la conservación limitada de las muestras6,7. Cuando esta tecnología está asociada con el software de análisis digital de imágenes, la interpretación de los datos es más eficiente y facilita el estudio del tumor y microambiente heterogeneidad8,9. En el presente Protocolo, una base de tyramide inmunofluorescencia (IF) método de multiplexación se aplica para amplificar la señal y es compatible con cualquier anticuerpo IHC-validado de cualquier especie, incluso los desarrollados en la misma especie5,7 , 10. el protocolo de tyramide permite la conjugación directa del fluoróforo al tejido de interés para que el anticuerpo primario y secundario puede ser despojado después de cada paso, permitiendo la aplicación secuencial de múltiples manchas sin reactividad cruzada del anticuerpo.
Una estrategia de multiplexado será útil para predecir el pronóstico y el tratamiento de los resultados mediante la identificación de objetivos y sus variante patrones inmunológicos en linfomas. MULTIPLEX fluorescente IHC se ha aplicado en nuestro laboratorio para el estudio de un panel de marcadores T y linfocitos B y T-folicular ayudante en linfoma angioimmunoblastic T-cell (AITL), un subtipo de linfoma T-cell periférico caracterizado por agresivas clínica comportamiento y tumor heterogeneidad11. La utilidad de este método se ilustra también en linfoma difuso de grandes células B (DLBCL) donde la mayor señalización de un receptor de células B con expresión simultánea de C-MYC y BCL-2 sugiere el posible uso terapéutico de la inhibición de la cinasa de tirosina de Bruton 12 . 
Aquí describimos el conjunto del Protocolo de validación del anticuerpo a la selección de tejidos de control apropiado y multiplexación usando linfoma FFPE tejidos, con un eventual análisis de diapositivas manchadas, utilizando un análisis automatizado de imágenes de patología cuantitativa sistema.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>REF S3022</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>For peroxide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra multispectral automated microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Vectra2.0.8</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1135</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF822001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF812001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL6</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-MYC</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy 5</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1171</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>Graph pad</td>
			<td></td>
			<td>Statisitcal software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoClear Clearing Agent</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H2779-1L</td>
			<td>Histoclear for dewaxing and clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced 
			Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Inform Software 2.2.1</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI67</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOS MILESTONE multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone</td>
			<td></td>
			<td>Microwave for Heat induced epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>PANASONIC</td>
			<td>NN-ST651M</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>81381 Aldrich Mowiol&#174; 4-88</td>
			<td>mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1488</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal520</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1487B21</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal540</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1494</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal620</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1495</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for tissue section adhesion in routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2367</td>
			<td>For HIER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer saline (TBS)</td>
			<td>1st BASE</td>
			<td>BUF3030 20X4L</td>
			<td>for buffer wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td>Tween</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma

Métodos de inmunohistoquímica (IHC) para el análisis in situ de la expresión de la proteína por microscopia ligera son una poderosa herramienta de investigación y diagnóstico. Sin embargo, la visualización y cuantificación de antígenos múltiples en una sección de tejido solo usando IHC cromogénico convencional es un reto. Proyección de imagen de multiplexado es especialmente relevante en linfoma investigación y diagnóstico, donde los marcadores tienen que interpretarse en el contexto de un microambiente tumoral compleja. Aquí se describe un protocolo para IHC fluorescente multiplexado tinción para posibilitar la evaluación cuantitativa de múltiples objetivos en tipos celulares específicos de interés en el linfoma. El método cubre aspectos de validación de anticuerpo, anticuerpo optimización, la optimización multiplex con marcadores de subtipos de linfoma, la tinción de tejido microarrays (TMA) y el escaneo de las diapositivas, seguido de análisis de datos, con específicas referencia a linfoma. Usando este método, partituras de la intensidad media de un marcador de interés y el porcentaje de positividad se generan para facilitar aún más el análisis cuantitativo. Multiplexación minimiza la utilización de la muestra y proporciona información espacial para cada marcador de interés.

MF-IHC imágenes una muestra de DLBCL con C-MYC y el cambio de gene de BCL2 (doble golpe linfoma) se muestran en la figura 1. La figura 2 ilustra las imágenes simuladas campo brillante de immunohistochemical. Figura 3 indica la generación de datos de porcentaje. Figura 4 muestra los detalles de una fórmula mediana para la generación de datos numéricos. <strong class...

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Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Aquí se describe un protocolo de immunohistochemical fluorescente multiplex la coloración y la proyección de imagen para la localización simultánea de múltiples antígenos asociados a cáncer de linfoma. Este protocolo puede ampliarse para el análisis de colocalización de marcadores biológicos en todas las secciones de tejido.

La coloración de Immunohistochemical fluorescente multiplexado, por imágenes y análisis en muestras histológicas de linfoma

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

Los linfomas son tumores histológicamente complejos. Por lo tanto, la inmunohistoquímica fluorescente multiplexada ofrece ventajas sobre la inmunohistoquímica cromogénica convencional para estudiar marcadores de interés en las células tumorales y el microambiente. Esta técnica tiene el potencial de estandarizar la puntuación de la tinción basada en anticuerpos en muestras de linfoma histológico, un proceso que históricamente ha sido difícil debido a la complejidad del microambiente tumoral.Específicamente, la inmunohistoquímica fluorescente multiplexada y las imágenes espectrales permiten la medición cuantitativa de múltiples manchas dentro de una sola diapositiva, permitiendo así la evaluación de la coexpresión del antígeno y la relación espacial dentro del material clínico. Comience sumergiendo los portaobjetos descerados y rehidratados en un tampón de recuperación de antígenos estándar en un frasco de vidrio guardado en microondas y realizando la recuperación de epítopos inducidos por el calor en un microondas adecuado. Realice rondas adicionales de desmontaje por microondas en función de la posición del anticuerpo en la secuencia multiplexada final.Por ejemplo, el cuarto anticuerpo requiere tres rondas adicionales de desmontaje de microondas antes de la tinción. Después de completar el proceso de desmontaje, utilice fórceps y guantes a prueba de calor para transferir los portaobjetos al agua destilada a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos de enfriamiento. Cuando la solución de recuperación de antígenos se haya enfriado, bloquee la actividad de la peroxidasa del tejido con un bloque comercial de peroxidasa durante 10 minutos seguido de un lavado de cinco minutos en solución salina tampón tris, o TBS, y un detergente no iónico.Bloquear cualquier tinción inespecífico con una incubación de 10 minutos en tampón de bloqueo seguida de incubación con el anticuerpo primario de interés a temperatura ambiente durante 30 minutos y tres lavados de cinco minutos con tampón TBS-D. A continuación, incubar las muestras con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante apropiado durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de tres lavados en tampón TBS-D como se ha demostrado. Después del último lavado, aplique un reactivo fluorescente adecuado a base de tiromida en los portaobjetos para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente seguida de tres lavados TBS-D de cinco minutos.Realice un desmontaje adicional a base de microondas para eliminar los anticuerpos primarios y secundarios en la solución de recuperación de antígenos frescos, como se ha demostrado. Al final de la recuperación, enfríe los portaobjetos en agua destilada y seque las áreas de los toboganes sin tejido con toallitas de laboratorio. Incubar el tobogán con dappy durante 10 minutos a temperatura ambiente seguido de tres lavados TBS-D.A continuación, seque cuidadosamente las diapositivas con toallitas de laboratorio sin ponerse en contacto con los tejidos y monte las muestras con un medio de montaje adecuado para la toma de imágenes. Para el escaneo de diapositivas monoplex, seleccione los filtros apropiados de los fluoróforos utilizados para etiquetar las muestras y examine cada marcador y su canal de fluorescencia correspondiente para identificar un tiempo de exposición adecuado para obtener una señal limpia, centrándose en el componente de tejido que debe tener la señal más fuerte para el marcador. Para permitir la comparación entre muestras de la intensidad de píxeles, utilice la configuración de la cámara en directo para ajustar el tiempo de exposición en cada canal individual hasta que no haya áreas sobreexpuestas en la imagen de la cámara en vivo.Cuando se hayan escaneado todas las diapositivas, adquiera imágenes de campo brillante simuladas para comparar visualmente con el patrón inmunohistoquímico normal y para determinar si el patrón de tinción es correcto. Para escanear diapositivas de microarray de tejido, utilice el modo de exploración de microarray de tejido en el sistema de imágenes y un algoritmo de enfoque automático adecuado. Para las diapositivas de sección de tejido entero, haga que las diapositivas sean revisadas por un patólogo calificado para seleccionar imágenes óptimas de las áreas tumorales más representativas.Antes de comenzar el análisis, seleccione un marcador tumoral para identificar las células de interés para el análisis. Pida a un patólogo que revise las imágenes y decida si se requiere segmentación de tejidos. Si es necesario, seleccione las regiones de control adecuadas para la segmentación y compruebe si el software de análisis de imágenes puede identificar correctamente dichas regiones.Después de la segmentación celular, pida al patólogo que revise el mapa de segmentación para garantizar la fidelidad del enfoque de segmentación previsto y revise imágenes individuales para determinar si la segmentación celular es adecuada o si se requiere una segmentación de tejido adicional para seleccionar regiones enriquecidas para células tumorales, estroma y o necrosis. A continuación, determine el valor de corte positivo de intensidad óptica para cada marcador junto con el patólogo y genere histogramas en un programa de software estadístico adecuado para analizar la distribución de frecuencia de la intensidad del marcador por celda. Para generar datos de porcentaje para marcadores específicos de interés dentro de celdas definidas, inserte una tabla dinámica en la hoja de datos y seleccione Suma para calcular el porcentaje de positividad de un único marcador de interés.Se calculará el número total de celdas positivas del marcador divididas por el número total. El resultado es el porcentaje de celda positiva del marcador con un núcleo o un número de estudio. Para generar datos numéricos, obtenga la intensidad media de cada marcador de interés en todas las células estudiadas dentro de una muestra para extraer el recuento normalizado medio para cada marcador de cada núcleo o número de estudio.Aquí, se muestran imágenes inmunohistoquímicas fluorescentes multiplexas representativas para una muestra difusa de linfoma de células B grandes con reordenamiento del gen C-MYC y BCL2. Las imágenes inmunohistoquímicas de campo brillante simuladas muestran un patrón similar de tinción de marcadores tumorales. La aplicación de imágenes inmunohistoquímicas fluorescentes multiplex a un panel de células T en linfomas de células T angioinmunoblásticos revela la heterogeneidad celular de la muestra tumoral.Aquí se muestra la optimización de una muestra de control de amígdalas y el análisis de datos resultante. Una variedad de programas de software de análisis de imágenes se pueden utilizar después del paso de desmezclado para cuantificar la expresión del marcador y la localización en las células tumorales y el microambiente tumoral. Esta técnica allana el camino para que los investigadores estudien la coexpresión de múltiples marcadores dentro de tipos celulares específicos en secciones de tejidos individuales del linfoma.Tenga cuidado de prevenir lesiones inducidas por calor durante las medidas de microwaving y ser consciente de los riesgos de caída durante los pasos de escaneo que se realizan en la cubierta.

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