Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma at JoVE.com

S.-B.N. och A.D.J. stöds av Singapore hälsoministeriets nationella medicinska forskning rådet övergången Awards (NMRC/TA/0020/2013 och NMRC-TA-0052/2016). Författarna erkänner Yong Siew Yoon forskningsbidrag till A.D.J. från National University Cancer Institute of Singapore mot inköp av Vectra spectral imaging Mikroskop. Studien är godkänd av Singapore NHG domän specifika översyn styrelsens B (2014/00693).

Alla vävnader som används i detta protokoll erhölls under det Singapore NHG domän specifika Review Board B studera 2014/00693.
1. urval och validering av antikroppar
Obs: Innan med etableringen av någon multiplexade panel, se till att alla antikroppar fläcken kraftfullt, att identifiera endast målet antigen av intresse. Syftet är att välja antikroppar som specifikt känner igen antigenet sevärdheter i vävnadssnitt.
<ol><li>För en antikropp med en väl ...

<ol>
	<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+revision+of+the+World+Health+Organization+classification+of+lymphoid+neoplasms.">The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms.</a> Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).</li><li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).</li><li>Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+for+Pathologists:+Protocols,+Pitfalls,+and+Tips.">Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+profiling+of+lymphoma.">Immunohistochemical profiling of lymphoma.</a> Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).</li><li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues.">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li><li>Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+Quantitative+Analysis+of+Protein+Expression.">Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Visualization+of+Multiple+Antigens+with+Tyramide+Signal+Amplification+using+Antibodies+from+the+same+Species.">Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Ng, S. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+a+Multiplexed+Immunofluorescence+Panel+in+T-Cell+Lymphoma.">Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma.</a> SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).</li><li>Bogusz, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+large+B-cell+lymphoma+with+concurrent+high+MYC+and+BCL2+expression+shows+evidence+of+active+B-cell+receptor+signaling+by+quantitative+immunofluorescence.">Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).</li><li>Kalyuzhny, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).</li><li>Bordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+validation.">Antibody validation.</a> BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual. , (2012).</li><li>Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+beyond+P+values:+Everyday+data+analysis+with+estimation+plots.">Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+Imaging+of+T+and+B+Cells+in+Murine+Spleen+and+Tumor.">Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor.</a> The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).</li></ol>

MF-IHC har potential att aktivera patologer att förfina diagnosticcriteria i lymfoida patologi och analysera rollen av biomarkörer i specifika celltyper mot en förutsägelse av kliniskt resultat. Som en ny forskningsmetod används alltmer mf-IHC kvantitativa och rumsliga identifiering av flera immun parametrar av tumör celler17. Påvisande av mf-IHC av samtidig uttryck för tumör biomarkörer har visat sig vara reproducerbara och pålitlig5. Tekniken är dock fortfaran...

Lymfoida tumörer orsakas av okontrollerad maligna spridningen av lymfocyter. Dessa celler är viktiga komponenter i immunsystemet och lokalisera till de primära och sekundära immun organ, såsom benmärg, lymfkörtlar, mjälte och andra slemhinnor-associerade lymfoida systemet. Lymfoida tumörer är en heterogen grupp av sjukdomar som klassificeras baserat på en konstellation av funktioner, inklusive morfologi, immunophenotype, genetiska särdrag och klinisk presentation. Varje parameter spelar en del, härstamning förblir en definierande funktion och utgör grunden för det WHO klassificeringssystem som erkänner tumörer härrör från B-celler, T-celler och naturliga killer (NK) celler1.
Nyckeln till klassificering av lymfom har varit karakterisering av antikroppar mot leukocyt yta markörer av olika undertyper av lymfocyter2. Immunhistokemi (IHC) har traditionellt använts för analys av sådana markörer och bygger på principen om antigen-antikroppsreaktion erkännande att upptäcka cell - och tissue-baserade molekyler som kan visualiseras genom mikroskopet ljus 3. identifiering av flera mål i en enda bild av konventionella ljusa fält kromogen multiplex IHC har dock begränsningar eftersom det är ofta svårt att skilja flera färg signaler på en enda vävnad avsnitt tillförlitligt — särskilt för antigen med en mycket låg uttryck4. Visuell bedömning och kvantifiering av färgning kan också vara subjektivt, orsakar variationer i analys och tolkning5.
Konventionella IHC på formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) prover är därför inte möjligt för samtidiga detektion av flera mål i immunologiskt olika sjukdomar som lymfom. Dessutom är skilja neoplastiska lymfocyter från omgivande immuncellerna ofta otydliga. Detta hindrar studier tittar på relevansen av nya biomarkörer i lymfom. I detta sammanhang multiplex fluorescerande IHC (mf-IHC) erbjuder ett lovande alternativ eftersom det tillåter den kvantitativa bedömningen av antigen coexpression och en rumslig relation med högre precision medan bevara begränsade prover6,7. När denna bildteknik är samarbetar med digital bild analys programvara, data tolkningen görs effektivare och underlättar studier av tumör och mikromiljö heterogenitet8,9. I detta protokoll, en tyramide-baserade immunofluorescens (om) multiplexing metod används för att förstärka signalen och är kompatibel med alla IHC-validerade antikroppar från någon värdarter, även de som utvecklats i samma arter5,7 , 10. tyramide-baserade protokollet möjliggör direkt konjugationen av fluorophore i vävnad av intresse så att de primära och sekundära antikroppen kan demonteras efter varje steg, vilket möjliggör sekventiell tillämpningen av flera fläckar utan antikropp korsreaktivitet.
En multiplexade strategi kommer att vara användbart för att förutsäga utfall prognos och behandling genom att identifiera mål och deras variant immunologiska mönster i lymfkörtelcancer. Multiplex fluorescerande IHC har tillämpats i vårt labb för studien av en panel av T- och B-lymfocyter markörer och T-follikulär helper markörer i angioimmunoblastic T-cells lymfom (AITL), en undertyp till en perifert T-cellslymfom kännetecknas av aggressiv klinisk beteende och tumör heterogenitet11. Nyttan av denna metod illustreras också i diffusa stora B-cellslymfom (DLBCL) där den ökad signalering av en B-cells receptor med samtidiga C-MYC och BCL-2 uttryck föreslår den potentiella terapeutiska användningen av Brutons tyrosin Kinas hämning 12 . 
Beskriver här vi hela protokollet från antikropp validering till valet av lämplig kontroll vävnader och vävnader, med en eventuell analys av färgade bilder med hjälp av en skanning multiplexing använder lymfom FFPE och automatiserade kvantitativa patologi imaging systemet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>REF S3022</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>For peroxide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra multispectral automated microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Vectra2.0.8</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1135</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF822001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF812001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL6</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-MYC</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy 5</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1171</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>Graph pad</td>
			<td></td>
			<td>Statisitcal software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoClear Clearing Agent</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H2779-1L</td>
			<td>Histoclear for dewaxing and clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced 
			Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Inform Software 2.2.1</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI67</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOS MILESTONE multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone</td>
			<td></td>
			<td>Microwave for Heat induced epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>PANASONIC</td>
			<td>NN-ST651M</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>81381 Aldrich Mowiol&#174; 4-88</td>
			<td>mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1488</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal520</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1487B21</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal540</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1494</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal620</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1495</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for tissue section adhesion in routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2367</td>
			<td>For HIER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer saline (TBS)</td>
			<td>1st BASE</td>
			<td>BUF3030 20X4L</td>
			<td>for buffer wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td>Tween</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma

Immunhistokemisk (IHC) metoder för in situ - analys av proteinuttryck av ljusmikroskop är ett kraftfullt verktyg för både forskning och diagnostiska ändamål. Men är den visualisering och kvantifiering av flera antigener i en enda vävnad avsnittet använda konventionella kromogen IHC utmanande. Multiplexade imaging är särskilt relevant i lymfom forskning och diagnostik, där markörer måste tolkas i samband med en komplex tumör mikromiljö. Här beskriver vi ett protokoll för multiplexering fluorescerande IHC färgning för att möjliggöra kvantitativa bedömningen av flera mål i specifika celltyper intresset för lymfom. Metoden omfattar aspekter av antikropp validering, antikropp optimering, multiplex optimering med markörer av lymfom subtyper, färgningen av vävnad microarray (TMA) diabilder, och skanning av bilderna, följt av analys, med särskild hänvisning till lymfom. Noter för båda genomsnittliga intensiteten av en markör av intresse och det procentuella positivitet skapas för att underlätta ytterligare kvantitativ analys och använder den här metoden. Multiplexing minimerar prov utnyttjande och tillhandahåller geografisk information för varje markör av intresse.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58711/58711fig1.jpg"> Figur 1: B-cell multiplexed immunofluorescens panelen bilder för en diffus stora B-cells lymfom (DLBCL) prov med C-MYC och CL2 gen ombildning (dubbel-hit lymfom). Magenta = CD20 (membran); vit = BCL2 (cytoplasman); gul = Ki67 (kärnkraft); grön = C-MYC (kärnkraft); röd = BCL6 (kärnkraft), blå = DAPI (nukleära kontrollfär...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma at JoVE.com

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Här beskriver vi ett protokoll för multiplex fluorescerande immunhistokemisk färgning och tänkbar för samtidiga localizationen av flera cancer-associerade antigener i lymfom. Detta protokoll kan utvidgas till en colocalization analys av biomarkörer inom alla vävnadssnitt.

Multiplexade fluorescerande immunhistokemisk färgning, bildbehandling och analys i histologiska prover av lymfom

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

Lymfom är histologiskt komplexa tumörer. Därför erbjuder multiplexed fluorescerande immunohistokemi fördelar jämfört med konventionella kromogena immunohistokemi att studera markörer av intresse i tumör cellerna och mikromiljö. Denna teknik har potential för att standardisera scoring av antikroppar baserade färgning i histologiska lymfom prover, en process som historiskt har varit utmanande på grund av komplexiteten i tumören mikromiljö.Specifikt, multiplexed fluorescerande immunohistokemi och spektrala imaging tillåter kvantitativa mätning av flera fläckar inom en enda bild, därigenom gör bedömningen av antigen co uttryck och spacial relation inom kliniskt material. Börja med att fördjupa de-vaxade och rehydrerade diabilder i en standard antigen hämtning buffert i en mikrovågsugn spara glasburk och utför värme-inducerad epitope hämtning i en lämplig mikrovågsugn. Utför ytterligare rundor av mikrovågs strippning baserat på antikroppens position i den slutliga multiplexsekvensen.Till exempel kräver den fjärde antikroppen ytterligare tre rundor av mikrovågs strippning före färgning. Efter slutförandet av strippningsprocessen, använd tåten och värmetäta handskar för att överföra rutschkanorna till destillerat vatten i rumstemperatur i minst 10 minuters nedkylning. När antigenhämtningslösningen har svalnat, blockera vävnadsperoxidasaktiviteten med ett kommersiellt peroxidasblock i 10 minuter följt av en fem minuters tvätt i tribuffrad saltlösning, eller TBS, och ett icke-joniskt rengöringsmedel.Blockera all ospecifik infärgning med en 10 minuters inkubation i blockerande buffert följt av inkubation med den primära antikroppen av intresse vid rumstemperatur i 30 minuter och tre fem minuters tvättar med TBS-D buffert. Därefter inkubera proverna med en lämplig pepparrotsperoxidaskonjugerad sekundär antikropp i 15 minuter vid rumstemperatur, följt av tre tvättar i TBS-D-buffert som påvisas. Efter den sista tvätten, applicera en lämplig tyramidbaserad fluorescerande reagens på objektglasen för en fem minuters inkubering vid rumstemperatur följt av tre fem minuters TBS-D tvättar.Utför en ytterligare mikrovåg baserad strippning för att avlägsna de primära och sekundära antikroppar i färska antigen hämtning lösning som visat. I slutet av hämtningen, kyl diabilderna i destillerat vatten och torka områdena på rutschkanorna utan vävnad med lab våtservetter. Inkubera glid med dappy i 10 minuter vid rumstemperatur följt av tre TBS-D tvättar.Torka sedan försiktigt objektglasen med labservetter utan att kontakta vävnaderna och montera proverna med ett lämpligt monteringsmedium för avbildning. För monoplexglasskanning, välj lämpliga filter från de fluoroforer som används för etikettering av proverna och undersök varje markör och dess motsvarande fluorescenskanal för att identifiera en lämplig exponeringstid för att få en ren signal, med fokus på den vävnadskomponent som bör ha den starkaste signalen för markören. Om du vill tillåta korsvis sampelsjämförelse av pixelintensiteten använder du inställningen för live-kamera för att justera exponeringstiden i varje enskild kanal tills det inte finns några överexponerade områden i den levande kamerabilden.När alla av bilderna har skannats, förvärva simulerade ljusa fältbilder att visuellt jämföra med den normala immunohistochemical mönster och att avgöra om färgning mönster är korrekt. För att skanna vävnad microarray diabilder, använd vävnaden microarray skanningsläge i bildsystemet och en lämplig auto fokus algoritm. För hela vävnad avsnitt diabilder, har de bilder som granskats av en kvalificerad patolog att välja optimala bilder från de mest representativa tumör områden.Innan du påbörjar analysen, välj en tumörmarkör för att identifiera de celler av intresse för analysen. Ha en patolog granska bilderna och besluta om vävnad segmentering krävs. Om det krävs väljer du lämpliga kontrollregioner för segmentering och kontrollerar om bildanalysprogramvaran kan identifiera sådana regioner på rätt sätt.Efter cellen segmentering, har patologen granska segmentering kartan för att säkerställa trohet av den avsedda segmentering strategi och granska enskilda bilder för att avgöra om cellen segmentering är tillräcklig eller om ytterligare vävnad segmentering krävs för att välja regioner berikade för tumörceller, stroma och eller nekros. Sedan bestämma den optiska intensiteten positiva cutoff värde för varje markör i samband med patologen och generera histogram i en lämplig statistik program programvara för att analysera frekvensfördelningen av markörintensiteten per cell. Om du vill generera procentuella data för specifika markörer av intresse inom definierade celler, infoga en pivottabell i databladet och välj Summa för att beräkna positivitetsprocenten för en enskild markör av intresse.Det totala antalet markör positiva celler dividerat med det totala antalet kommer att beräknas. Resultatet är markören positiva cell procent med en kärna, eller en studie nummer. För att generera numeriska data, få medelintensiteten för varje markör av intresse i alla celler studie inom ett prov för att extrahera medianen normaliserade räkna för varje markör för varje kärna eller studie nummer.Här visas representativa multiplex fluorescerande immunohistochemical bilder för en diffus stora B-cells lymfom prov med c-MYC och BCL2 gen rearrangement. Simulerade ljusa fältet immunohistochemical bilder visar en liknande tumör markör färgning mönster. Tillämpningen av multiplex fluorescerande immunohistochemical bilder till en T-cell panel i angioimmunoblastic T-cells lymfom avslöjar cellen heterogenitet av tumörprovet.Här visas optimering av ett tonsillkontrollprov och den resulterande dataanalysen. En mängd olika program bildanalys programvara kan användas efter det oblandande steg för att kvantifiera markör uttryck och lokalisering i tumörceller och tumören mikromiljö. Denna teknik banar väg för forskare att studera co uttryck för flera markörer inom specifika celltyper i enstaka vävnader delar av lymfom.Var försiktig för att förhindra värmeinducerad skada under de mikrowaving stegen och vara medveten om fallrisker under scanningsstegen som utförs i däcket.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Härledning av thymic Lymfom T-cellinjer från Atm - / -</sup Och P53 - / -</sup Möss

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Användning av fluorescerande Immuno-kemi för upptäckt av Edwardsiella ictaluri I kanal havskatt ( I. punctatus) Prover

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Multiplex detektion av bakterier i komplex klinisk och miljöprover med Oligonucleotide-kopplad fluorescerande mikrosfärer

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Icke-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Fluorescence optisk avbildning av inflammatorisk MMP aktivitet Använda en aktiverbar Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Mycket multiplexerad, superupplösning av T-celler med hjälp av madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Användning av kapslar för negativ färgning av virala prov inom biokonstruktion

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

Histologiska kvantifiering att bestämma Lung svamp börda i experimentell aspergillos

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

Med hjälp av robotsystem att bearbeta och bädda in kolon murina prover för histologiska analyser

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Förbättrad rabies övervakning med hjälp av en direkt snabb immunohistokemisk test

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...