Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma at JoVE.com

S.-B.N. ve A.D.J. Singapur Sağlık Bakanlığı'nın Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi geçiş ödüller tarafından (NMRC/TA/0020/2013 ve NMRC/TA/0052/2016) desteklenir. Yazarlar bir Yong Siew Yoon araştırma hibe Singapur Ulusal Üniversitesi Kanser Enstitüsü Vectra spektral görüntüleme mikroskop satın doğru gelen A.D.J. için kabul. Bu çalışmada Singapur NHG etki alanı belirli İnceleme Kurulu B tarafından onaylanmıştır (2014/00693).

Bu protokol için kullanılan tüm dokularda Singapur NHG etki alanı belirli İnceleme Kurulu B altında elde edilmiştir 2014/00693 çalışma.
1. seçimi ve doğrulama antikorların
Not: herhangi bir çoğaltılmış paneli kurulması ile devam etmeden önce tüm antikorlar sağlam, yalnızca hedef antijen ilgi tanımlayan leke emin olun. Amacı özellikle doku bölümleri ilgi antijen tanıdınız antikorlar seçmektir.
<ol><li>Pozitif ve negatif kontrol doku ...

<ol>
	<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).</li><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+revision+of+the+World+Health+Organization+classification+of+lymphoid+neoplasms.">The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms.</a> Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).</li><li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).</li><li>Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+for+Pathologists:+Protocols,+Pitfalls,+and+Tips.">Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+profiling+of+lymphoma.">Immunohistochemical profiling of lymphoma.</a> Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).</li><li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues.">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li><li>Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+Quantitative+Analysis+of+Protein+Expression.">Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Visualization+of+Multiple+Antigens+with+Tyramide+Signal+Amplification+using+Antibodies+from+the+same+Species.">Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Ng, S. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+a+Multiplexed+Immunofluorescence+Panel+in+T-Cell+Lymphoma.">Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma.</a> SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).</li><li>Bogusz, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+large+B-cell+lymphoma+with+concurrent+high+MYC+and+BCL2+expression+shows+evidence+of+active+B-cell+receptor+signaling+by+quantitative+immunofluorescence.">Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).</li><li>Kalyuzhny, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).</li><li>Bordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+validation.">Antibody validation.</a> BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual. , (2012).</li><li>Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+beyond+P+values:+Everyday+data+analysis+with+estimation+plots.">Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+Imaging+of+T+and+B+Cells+in+Murine+Spleen+and+Tumor.">Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor.</a> The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).</li><li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).</li></ol>

MF-IHC patologlar diagnosticcriteria içinde lenfoid patoloji rafine ve biyolojik belirli hücre tiplerinin klinik sonuç bir tahmin doğru olarak rolü çözümlemek için etkinleştirmek için potansiyele sahiptir. Yeni bir araştırma yöntemi olarak mf-IHC giderek tümör hücreleri17birden çok bağışıklık parametre nicel ve mekansal tanımlaması uygulanır. Mf-IHC tümör biyolojik ortak bir ifade için algılama tekrarlanabilir ve güvenilir5olmak gösterilmişt...

Lenfoid neoplazmlar lenfositler tarafından malign kontrolsüz çoğalması kaynaklanır. Bu hücreler bağışıklık sisteminin önemli bileşenleri ve kemik iliği, lenf düğümleri, dalak ve diğer mukoza ilişkili lenfoid sistemi gibi birincil ve ikincil bağışıklık organlara localize. Lenfoid neoplazmlar morfoloji, immunophenotype, genetik özellikleri ve klinik sunum dahil olmak üzere özellikleri, bir takımyıldızı üzerinde göre sınıflandırılır bozuklukları heterojen bir grup vardır. Her parametre bir rol oynar, lineage bir belirleyici özelliği, kalır ve B hücreleri, T hücreleri ve doğal öldürücü (NK) hücreleri1elde neoplazmlar tanıyan WHO sınıflandırma sistemi temelini oluşturur.
Anahtar lenfoma sınıflandırılması için lökosit yüzey işaretleyicileri lenfositler2çeşitli alt türlerinden karşı antikor karakterizasyonu olmuştur. İmmünhistokimya (IHC) geleneksel olarak böyle işaretleri analiz için kullanılan ve ışık mikroskobu görüntülenmiştir hücre ve doku esaslı molekülleri algılamak için spesifik antijen-antikor tanıma prensibi temel alır 3. ancak, genellikle birden çok renk sinyalleri bir tek doku bölümünde güvenilir bir şekilde ayırt etmek zor olduğu için geleneksel alan parlak chromogenic multiplex IHC tarafından tek bir slayda birden çok hedef tanımlaması sınırlamaları vardır — özellikle bir çok düşük ifade4ile antijenleri için. Görsel değerlendirme ve boyama miktar da öznel, analiz ve veri yorumu5' te değişkenlik neden olabilir.
Bu nedenle, geleneksel IHC formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) örnekleri üzerinde aynı anda birden çok hedef lenfoma gibi immunologically çeşitli hastalıklarda tespiti için mümkün değildir. Ayrıca, çevredeki bağışıklık hücreleri neoplastik lenfositler ayırt kez imprecise. Bu lenfoma roman biyolojik alaka bakarak çalışmaları engeller. Bu bağlamda, multiplex floresan IHC (mf-IHC) antijen coexpression nicel bir değerlendirme sağlar ve mekansal ilişki sınırlı korunması ise daha yüksek hassasiyet ile6,örnekleri olarak umut verici bir alternatif sunuyor7. Bu görüntüleme teknolojisi dijital görüntü analiz yazılımı ile ortaklık, veri yorumu daha verimli hale ve tümör ve microenvironment heterojenlik8,9çalışma kolaylaştırır. Bu iletişim kuralı yöntemi çoğullama tyramide tabanlı bir ayirt (Eğer) sinyali yükseltmek için uygulanır ve herhangi bir IHC doğrulanmış antikor türlerden herhangi bir ana bilgisayar, hatta aynı tür5,7 ' geliştirilen ile uyumludur , 10. tyramide tabanlı iletişim kuralı için fluorophore faiz dokuya doğrudan konjugasyon sağlar, böylece birden fazla lekeleri sıralı uygulama için izin önce her defasında, birincil ve ikincil antikor elimden antikor olan.
Çoğaltılmış bir strateji lenfomalarin bazilarinin varyant onların immünolojik desenleri ve hedefler belirleyerek teşhis ve tedavi sonuçları tahmin için faydalı olacaktır. Multiplex floresan IHC T ve B lenfosit işaretleri ve angioimmunoblastic T-Hücre Lenfomasi (AITL), T-foliküler yardımcı işaretleyicilerini bir panel incelenmesi için bizim laboratuvarında uygulanan alt türü olan periferik T Hücre Lenfomasi karakterize agresif tarafından klinik davranış ve tümör heterojenite11. Belgili tanımlık yarar bu yöntemin de nerede bir B-hücre reseptör eşzamanlı C-MYC ve BCL-2 ifadesi ile artan sinyal Bruton'ın Tirozin kinaz inhibisyon potansiyel terapötik kullanım öneriyor diffüz büyük B hücreli lenfoma içinde (DLBCL) resimli 12 . 
Burada tüm antikor doğrulama kuralından seçime uygun denetim dokuların açıklamak ve lenfoma FFPE kullanarak çoğullama kurcalayarak lekeli slaytlar bir tarama kullanarak nihai bir analizini otomatik nicel patoloji görüntüleme sistem.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>REF S3022</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>For peroxide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra multispectral automated microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Vectra2.0.8</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1135</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF822001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>NEF812001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL6</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-MYC</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy 5</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1171</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>Graph pad</td>
			<td></td>
			<td>Statisitcal software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoClear Clearing Agent</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H2779-1L</td>
			<td>Histoclear for dewaxing and clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced 
			Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Inform Software 2.2.1</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI67</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOS MILESTONE multifunctional tissue processor</td>
			<td>Milestone</td>
			<td></td>
			<td>Microwave for Heat induced epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>PANASONIC</td>
			<td>NN-ST651M</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>81381 Aldrich Mowiol&#174; 4-88</td>
			<td>mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1488</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal520</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1487B21</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal540</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1494</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal620</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1495</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for tissue section adhesion in routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>PERKIN ELMER</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2367</td>
			<td>For HIER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer saline (TBS)</td>
			<td>1st BASE</td>
			<td>BUF3030 20X4L</td>
			<td>for buffer wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td>Tween</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma

İmmunohistokimyasal (IHC) yöntemleri protein ifade tarafından ışık mikroskobu in-situ analizi için araştırma ve teşhis amaçlı güçlü bir araç vardır. Ancak, görselleştirme ve miktar geleneksel chromogenic IHC kullanarak bir tek doku bölümünde birden çok antijenleri zorlu. Çoğaltılmış görüntü burada işaretleri karmaşık tümör microenvironment bağlamında yorumlanmalıdır lenfoma araştırma ve teşhis, özellikle alakalı olduğunu. Burada bir iletişim kuralı için birden çok hedef belirli hücre türleri lenfoma ilgi kantitatif değerlendirilmesi etkinleştirmek için boyama çoğaltılmış floresan IHC açıklar. Yöntem sunumunun antikor doğrulama, antikor optimizasyonu, lenfoma alt türlerinden işaretçileri olan optimizasyon multiplex, boyama doku Mikroarray (TMA) slayt ve slayt, tarama veri analizi, özel ile takip Lenfoma için başvuru. Bu yöntemi kullanarak, bir işaretleyici faiz ve yüzde pozitif her iki ortalama yoğunluğu için bir puan daha fazla Nicel analiz kolaylaştırmak için oluşturulur. Çoğullama örnek kullanımını en aza indirir ve ilgi her işaretçi için mekansal bilgi sağlar.

MF-IHC görüntüler için C-MYC ve BCL2 gen düzenlenmesi (çift-hit lenfoma) ile DLBCL örnek Şekil 1' de gösterilmektedir. Şekil 2 simüle alan parlak immunohistokimyasal görüntüleri gösterir. Şekil 3 yüzde veri nesil gösterir. Şekil 4 nesil sayısal veri için Ortalama bir formül ayrıntılarını görüntüler. Şekil 5 angi...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma at JoVE.com

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Burada tarif biz multiplex floresan immunohistokimyasal boyama ve lenfoma içinde birden fazla kanser ilişkili antijenleri eş zamanlı yerelleştirme için görüntüleme için bir iletişim kuralı. Bu iletişim kuralı tüm doku bölümleri içinde biyolojik colocalization analizine genişletilebilir.

Çoğaltılmış floresan immunohistokimyasal boyama, görüntüleme ve analiz lenfoma histolojik örneklerinde

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

Lenfomalar histolojik olarak karmaşık tümörlerdir. Bu nedenle, çok katlı floresan immünohistokimya tümör hücreleri ve mikroortamda ilgi belirteçleri çalışma için konvansiyonel kromojenik immünohistokimya üzerinde avantajlar sunuyor. Bu teknik histolojik lenfoma örneklerinde antikor bazlı boyama puanlama standartlaştırma potansiyeline sahiptir, tarihsel tümör mikroortamının karmaşıklığı nedeniyle zorlu bir süreçtir.Özellikle, çok katlı floresan immünohistokimya ve spektral görüntüleme tek bir slayt içinde birden fazla leke kantitatif ölçüm sağlar, böylece klinik malzeme içinde antijen co ekspresyon ve aralıklı ilişkinin değerlendirilmesi sağlar. Bir mikrodalga kaydetmek cam kavanoz standart bir antijen alma tampon de-mumlu ve rehydrated slaytlar daldırma ve uygun bir mikrodalga ısı kaynaklı epitop alma gerçekleştirerek başlayın. Son multipleks dizisinde antikor konumuna göre mikrodalga sıyırma ek tur gerçekleştirin.Örneğin, dördüncü antikor boyama önce mikrodalga sıyırma üç ek tur gerektirir. Sıyırma işlemi tamamlandıktan sonra, en az 10 dakika soğuması için oda sıcaklığında distile suya slaytlar aktarmak için forseps ve ısıya dayanıklı eldiven kullanın. Antijen alma solüsyonu soğuduğunda, ticari bir peroksidaz bloğu ile doku peroksidaz aktivitesini 10 dakika boyunca bloke edin ve ardından tris-tamponlu salin veya TBS'de beş dakikalık bir yıkama ve iyonik olmayan bir deterjan.Tamponu bloke eden 10 dakikalık bir kuluçka ile spesifik olmayan lekeleri engelleyin ve ardından oda sıcaklığında ana ilgi antikorunu 30 dakika ve TBS-D tamponu ile üç beş dakikalık yıkar. Daha sonra, uygun bir horseradish peroksidaz ile kuluçka oda sıcaklığında 15 dakika ikincil antikor konjuge, gösterildiği gibi TBS-D tampon üç yıkar izledi. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında beş dakikalık kuluçka için slaytlara uygun bir tiramid bazlı floresan reaktif uygulayın ve ardından üç beş dakikalık TBS-D yıkayın.Gösterildiği gibi taze antijen alma çözeltisi birincil ve ikincil antikorları kaldırmak için ek bir mikrodalga tabanlı sıyırma gerçekleştirin. Geri alma sonunda, distile suda slaytlar serin ve laboratuvar mendilleri ile doku olmadan slaytlar üzerinde alanları kuru. Oda sıcaklığında 10 dakika dappy ile inküböz slayt üç TBS-D yıkayArak takip.Daha sonra, dokulara temas etmeden laboratuar mendilleri ile slaytları dikkatlice kurulayın ve numuneleri görüntüleme için uygun bir montaj ortamıyla monte edin. Monopleks slayt taraması için, numuneleri etiketlemek için kullanılan floroforlardan uygun filtreleri seçin ve işaretçi için en güçlü sinyale sahip olması gereken doku bileşenine odaklanarak temiz bir sinyal elde etmek için uygun bir pozlama süresini belirlemek için her belirteç ve buna karşılık gelen floresan kanalını inceleyin. Piksel yoğunluğunun çapraz örnekkarşılaştırmasına izin vermek için, canlı kamera görüntüsünde aşırı pozlanmış alanlar kalmadan her bir kanaldaki pozlama süresini ayarlamak için canlı kamera ayarını kullanın.Tüm slaytlar tarandığında, normal immünohistokimyasal desenle görsel olarak karşılaştırmak ve boyama deseninin doğru olup olmadığını belirlemek için simüle edilmiş parlak alan görüntüleri edinin. Doku mikrodizi slaytlarını taramak için görüntüleme sistemindeki doku mikrodizi tarama modunu ve uygun bir otomatik odaklama algoritmasını kullanın. Tüm doku kesiti slaytları için, slaytlar en temsili tümör bölgelerinden optimal görüntüleri seçmek için nitelikli bir patolog tarafından gözden geçirilir.Analize başlamadan önce, analiz için ilgi hücreleri tanımlamak için bir tümör belirteci seçin. Bir patolog görüntüleri gözden ve doku segmentasyonu gerekli olup olmadığına karar verin. Gerekirse, segmentasyon için uygun denetim bölgelerini seçin ve görüntü çözümleme yazılımının bu bölgeleri doğru şekilde tanımlayıp tanımlayamadığını kontrol edin.Hücre segmentasyonundan sonra, patoloğun amaçlanan segmentasyon yaklaşımının doğrulmasını sağlamak için segmentasyon haritasını gözden geçirmesini ve hücre segmentasyonunun yeterli olup olmadığını veya tümör hücreleri, stroma veya nekroz için zenginleştirilmiş bölgeleri seçmek için ek doku segmentasyonu gerekip gerekmediğini belirlemek için tek tek görüntüleri gözden geçirmesini sağlayın. Daha sonra patolog ile birlikte her belirteç için optik yoğunluk pozitif kesme değerini belirlemek ve hücre başına marker yoğunluğu frekans dağılımıanaliz etmek için uygun bir istatistik yazılım programında histogramlar oluşturmak. Tanımlı hücreler içinde belirli ilgi işaretleri için yüzde verileri oluşturmak için, veri sayfasına bir özet tablo ekleyin ve tek bir ilgi işaretinin pozitiflik yüzdesini hesaplamak için Toplam'ı seçin.Toplam sayıya bölünen işaretleyici pozitif hücrelerin toplam sayısı hesaplanır. Sonuç, bir çekirdek veya bir çalışma numarası ile marker pozitif hücre yüzdesidir. Sayısal veri oluşturmak için, her çekirdek veya çalışma numarasının her bir belirteci için ortanca normalleştirilmiş sayımı ayıklamak için bir örnek teki tüm hücre çalışmalarında ilginin ortalama yoğunluğunu elde edin.Burada c-MYC ve BCL2 gen rearanyaygın büyük B hücreli lenfoma örneği için temsili multiks floresan immünhistokimyasal görüntüler gösterilmiştir. Simüle parlak alan immünohistokimyasal görüntüler benzer bir tümör belirteç boyama deseni göstermektedir. Anjiyoimmünoblastik T-hücreli lenfomalarda t-hücre paneline multiks floresan immünohistokimyasal görüntülerin uygulanması tümör örneğinin hücreheterojenliğini ortaya koymaktadır.Burada bademcik kontrol numunesinin optimizasyonu ve elde edilen veri analizi gösterilmiştir. Tümör hücrelerinde ve tümör mikroortamında marker ekspresyonu ve lokalizasyonu niantitate için karıştırma aşamasından sonra çeşitli görüntü analizi yazılım programları kullanılabilir. Bu teknik, araştırmacıların lenfomanın tek doku bölümlerinde belirli hücre tipleri içinde birden fazla belirteçlerin ortak ekspresyonunu incelemelerinin önünü açıyor.Mikro dalgalı adımlar sırasında ısıya bağlı yaralanmaları önlemeye özen ve güvertede gerçekleştirilen tarama adımları sırasında düşme risklerine dikkat edin.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Timik Lenfoma T-hücre Hatları türetilmesi Atm - / -</sup Ve P53 - / -</sup Fare

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Floresan immuno-Kimya tespiti için kullanılması Edwardsiella ictaluri Kanal kedibalığı ( I. punctatus) Örnekleri

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Oligonükleotid çiftli Floresan Mikroküreler kullanarak Kompleksi Klinik ve Çevre Örneklerinde Bakterilerin Multiplex Algılama

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invaziv<emIn vivo</em&gt; Aktive Edilebilir Floresan Görüntüleme Ajanını Kullanan İnflamatuvar MMP Aktivitesinin Flüoresan Optik Görüntülemesi

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Madstorm kullanarak T hücrelerinin çok yönlü, süper çözünürlüklü görüntüsü

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Viral Örneklerin Negatif Boyanması İçin Kapsüllerin Biyokontainment İçerisinde Kullanımı

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

Deneysel aspergilloz akciğer mantar yükünü belirlemek için histolojik miktar

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

Robot sistemleri kullanarak işlemek ve histolojik analizler için kolon fare örnekleri katıştır

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Doğrudan hızlı Immünhistokimyasal testi kullanarak gelişmiş kuduz gözetimi

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...