逆転写を分析するこの新しい方法は、レトロウイルス学の分野に関する新しいことを教えてくれます。例えば、細胞制限因子がどのように機能するか、抗レトロウイルス薬がHIV1 DNA合成を阻害する方法の詳細について学ぶことができます。この技術の主な利点は、Nascentリバーストランスクリプスの配列に関する情報を提供するだけでなく、単一の核タイト解像度で正確な3プライムDNA末流のマッピングを可能にすることです。
HIV1感染細胞の卸売DNAからのHIV1の無料DNAの濃縮は、ハイブリッド捕獲によって行われ、PCRワークステーションで行われるべきである。サンプルあたり100マイクロのマイクロ遠心管に100マイクロのビーズを向けて磁気ストレプトアビジンビーズのマスターミックスを準備し、マイクロ遠心管に適した磁石の上にチューブを置きます。ビーズがチューブのマグネット側に向かって落ち着いたら、貯蔵バッファーを取り外し、マグネットからチューブを取り出し、ビーズを500マイクロリットルのビンバインド洗浄またはBWバッファーに再び懸濁します。
チューブを磁石の上に戻し、ビーズが磁石に移動するのを待ち、上清を取り除きます。マグネットからチューブを取り出し、500マイクロリットルのカゼイン溶液を加え、ビーズを再び懸濁し、室温で10分間インキュベートします。10分後、ビーズをBWバッファーで洗います。
チューブを磁石に戻し、上清を取り外し、ビーズを500マイクロリットルのBWバッファに再び懸濁します。サンプルごとに捕獲されたビオチン化オリゴヌクレオチドのピコモレスを50個加えます。エンドミキサーで30分間揺れながら室温でインキュベートします。
次に、チューブを磁石に戻し、上澄み物を取り出し、磁石からチューブを取り出し、1x 10バッファの500マイクロリットルを加え、ビーズを再び中断します。2回目の洗浄後、固定化されたオリゴヌクレオチドを用いたビーズを10マイクロリットルの10マイクロリットルのサンプルあたり10個のバッファーで再び懸濁させる。各サンプルに対して、1つのマイクロセトロフュージチューブにラベルを付け、ビーズ懸濁液10マイクロリットル、170マイクロリットルのDNA、3x 10バッファの90マイクロリットルを加えます。
DNAを自然に分離するために摂氏92度の乾燥した熱ブロックで2分間インキュベートする。チューブを摂氏502度に設定された別の乾燥熱ブロックに移動し、1時間インキュベートします。このインキュベーション中に10分ごとに、チューブを反転して混合します。
1時間のインキュベーションが行われたら、ビーズを1x1バッファーの500マイクロリットルで1回洗浄し、ヌクレアーゼを含まない35マイクロリットルに再び懸濁します。液体を取り除く前に約3分間磁石の上にチューブを残してビーズがうまく落ち着くようにします。溶出するには、乾燥した熱ブロックで92度のチューブを2分間インキュベートします。
その後、素早くマグネットにチューブを1つずつ移動します。ビーズがチューブの側面に結合されたら、HIV1DNAを含む上清を新鮮なチューブに移します。この手順を開始するには、凍結乾燥したアダプターをヌクレアーゼフリー水中の100マイクロモルで再中断し、チューブを渦に入れます。
サンプルあたり、および1つの対照サンプルを加えて、ゼロポイント4 5マイクロリットルの10x T4 DNAリガーゼバッファー、4マイクロリットルのアダプター、およびヌクレアーゼフリー水のポイントゼロ5マイクロリットルを組み合わせます。2分間摂氏92度に加熱し、PCR機でゆっくりと摂氏16度まで冷却します。これにより、アダプターがヘアピン構造を形成できるようになります。
この手順の重要なステップは、3-プライムDNA末語を開くために適応された分子の効率的で公平な結紮です。精製された新生cDNA分子は、T4 DNAリガーゼを用いてヘアピン単本鎖DNAアダプターに連結される。アダプターは、ランダムな6ヌクレオチドバーコード配列を運び、ライゲーションを容易にするために解析を可能にし、同時にユニークな読み取りの識別子として機能します。
3素級のシロミニアダプターは、自己結紮を防ぐためにスペーサーを運ぶ。60マイクロリットルの最終体積ライゲーション反応を設定するには、各PCRチューブに、10x T4 DNAリガーゼバッファーの6マイクロリットル、40%PEGの24マイクロリットル、5モルベタインの6マイクロリットル、4ポイント5マイクロリットルのアダプター、1ポイント2マイクロリットルのT4 DNAリガーゼ、およびDNAの18ポイントマイクロリットルを追加します。反応をよく混合した後、一晩摂氏16度でPCR機でインキュベートする。
アダプター結紮の翌日、DNAゲルローディングバッファーを含むホルムアミドの30マイクロリットルで各ライゲーション反応に、パイプの見出しによってよく混合する。PCRマシンで摂氏94度で2分間加熱し、すぐに氷の上に置きます。次のステップは、変性ゲル電気泳動の準備です。
適切なゲルタンクにプレキャスト6%TBE変性尿素ポリアクリルアミドゲルを入れ、1x TBEランニングバッファを追加します。ゲルを20分間前に実行してください。次に、シリンジと21ゲージ針を使用して、ランニングバッファ付きのゲルポケットを洗い流します。
その後、同じサンプルのウェルあたり30マイクロリットルを3つの井戸に積み込みます。クロス汚染を避けるために、ゲルごとに1つのサンプルのみを実行することをお勧めします。20分間実行します。
ゲルが動いている間に、21ゲージの注射針を使用して底に穴を突き刺すことによって、サンプルごとに3つのゼロポイント5ミリリットルマイクロ遠心分離管を準備します。準備したチューブをそれぞれ2つのミリリットルマイクロ遠心分離管に挿入し、サンプル名に低、中、または高いラベルを付けます。ダークブルーの染料の前面がゲルの約半分の方にある場合は、電気泳動を停止し、ゲルカセットを取り外します。
カセットをこじ開け、カミソリでゲルを縦に切ります。負荷のサンプルの3つの井戸でストリップを寛大に切除する。1x TBEと5マイクロリットルのシアニン核酸染色を含む容器にゲルストリップを加え、3〜5分間インキュベートします。
後で取り外すフリーアダプターの上部を容易に識別するために、染色が十分であることを確認してください。次に、青い光のトランイルミネーターの表面を、蒸留された脱イオン水で十分に洗浄します。その後、染色容器からゲル片を取り出し、ライトボックスの上に置きます。
ライトボックスの電源を入れ、オレンジ色のフィルターを通して染色された核酸を検査します。染色ゲル上の代表的な連結DNAサンプルを、ここに示す。アダプターは通常、過負荷に見え、ストリークとして上記で実行されるリゲーテッドHIV1 DNAを持つ大きなブロブとして実行されます。
赤い線は、ゲルが切断されて自由なアダプターを取り除き、サンプルを3つの偶数に分割する部位を示しています。新しいカミソリの刃を使用して、サンプルがロードされていない領域がまだ存在しない場合は、ゲルの側面を切り取ります。次に、アダプターのすぐ上に切り、アダプターと下部のゲル部品を取り除きます。
最後に、高分子量DNAの鋭い強烈なシグナルを持つゲルポケットの約1ミリメートルを含むゲルの一番上を切り取ります。サンプルを含む残りのゲルピースを3つの偶数に分割します。低、中、高分子量領域。
次に、3つのゲル断片を2ミリメートルずつ2つに切り、準備されたゼロポイント5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移します。開いた蓋で1分間、最高速度でスピンします。2ミリリットルチューブに穴を通してゲル片を絞り、ゲルスラッシュを作成します。
ゲル粒子がゼロ点5ミリリットルチューブの底に残っている場合は、針を使用して手動で2ミリリットルチューブに移します。各マイクロ遠心分離管のゲルスラッシュに1ミリリットルの尿素ゲル抽出バッファーを加えることによってDNA抽出手順を開始します。室温でエンドミキサーの端でチューブを最低3時間回転させます。
フィルター列を準備します。ピンセットをクリーンセットで使用して、セルロースアセテート膜フィルターを使用して各遠心分離機列に1つの小さな丸いガラス繊維フィルターを追加し、膜の詰まりを防ぎます。逆パイプヘッドチップでフィルターを所定の位置に置きます。
ゲルスラッシュと抽出バッファーを含む 2 本のミリリットルチューブをマイクロ遠心分離機で簡単に回転させ、700 マイクロリットルの上清を準備したフィルターカラムに移します。フィルター列を最高速度で1分間、マイクロ遠心分離機で遠心分離します。その後、流れを新しい2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに流し込みます。
残りの上清を使用して列を再ロードします。抽出スラッシュからできるだけ多くの液体を得るようにしてください、そしてゲル片が含まれている場合は気にしないでください。もう一度スピンします。
同じ抽出サンプルのフローを結合し、テキストプロトコルで説明されているように進みます。このプロトコルは、抗レトロウイルスヒトタンパク質A3Gの存在または存在下でVif欠損HIV-1に感染したCEMS-ST細胞からのサンプルに使用された。各サンプルから得られた一意の読み取りの総数のプロットは、A3Gのレベルを上げると、総読み取り数が減少することを示しています。
逆転写酵素媒介cdna合成に対するA3Gの阻害効果を反映する。これら次の3つのプロットでは、最初の182ヌクレオチド内の各可能な長さで分子の割合が青色ヒストグラムで示されている。A3Gの添加は、いくつかの非常に特異的な再現可能な位置で短い切り捨てられたcdna分子の急激な増加を犠牲にした。
破線の赤線は、それぞれの位置でC〜T突然変異を運ぶ読み取りの割合を示す。陽性のコントロールは、知っている配列、長さおよび濃度の合成オリゴヌクレオチドのプールを処理することによって生成することができる。すべての分子は、小さなバリエーションだけで同じ存在に近い存在で現れるべきです。
ライブラリの実行が小さな長さのバイアスを生成する場合は、シーケンスで、サイズバイアスを表す傾斜から派生した正規化係数を適用することをお勧めします。この手順は、DNA分子の3つの素端を決定すると、核酸代謝の可能性に関する重要な洞察を追加する他のシステムに容易に適応することができます。HIVとの作業は非常に危険であり、一部の感染症は指定された安全研究所でのみ行われるべきであることを忘れないでください。
