Name: in vivo targeted expression of optogenetic proteins using silk/aav films
Uploaded: 2019-02-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films at JoVE.com

الكتاب أود أن أشكر فاسكويز جيه للرسوم التوضيحية وكابلان دال وجيم بريدًا الكواشف وتوجيهات مفيدة، ومختبرات ساباتيني باء وجيم هارفي للتصوير في فيفو . الفحص المجهري وأمكن أوكانا م ومركز تصوير بيولوجيا الأعصاب، تدعمها جزئيا مركز التصوير العصبي كجزء من "الوطني المعهد من الاضطرابات العصبية" و "السكتة الدماغية" (NINDS) P30 الأساسية مركز منح (NS072030). وأيد هذا العمل من مؤسسة الأسرة خوداداد جبر، والمؤسسة، و "علامات لوري نانسي" بمنح المعاهد الوطنية للصحة، R21NS093498 نيندس، U01NS108177 و R35NS097284 نيندس إلى W.G.R، ومن المعاهد الوطنية للصحة ما بعد الدكتوراه زمالة F32NS101889 إلى C.H.C.

أجريت جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها "اللجنة الدائمة هارفارد" في "رعاية الحيوان" ووصف المبادئ التوجيهية التالية في "المعاهد الوطنية للصحة لنا" دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. واستخدمت الفئران C57BL/6 الكبار من كلا الجنسين (6-15 أسبوعا ع?...

<ol>
	<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Tervo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Designer+AAV+Variant+Permits+Efficient+Retrograde+Access+to+Projection+Neurons.">A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+Fibroin+Films+Facilitate+Single-Step+Targeted+Expression+of+Optogenetic+Proteins.">Silk Fibroin Films Facilitate Single-Step Targeted Expression of Optogenetic Proteins.</a> Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).</li><li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue.">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), e50004 (2012).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors.">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time.">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits.">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).</li><li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cortical,+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses.">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+sectioning+of+slice+preparations+for+immunohistochemistry.">Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), 194 (2007).</li><li>Cao, Y., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+silk+biomaterials.">Biodegradation of silk biomaterials.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (4), 1514-1524 (2009).</li><li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission.">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li><li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nature Neuroscience. 13 (5), 584-591 (2010).</li><li>Hines, D. J., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+controlled+release+from+silk+fibroin+films.">Mechanisms of controlled release from silk fibroin films.</a> Biomacromolecules. 12 (3), 804-812 (2011).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+silk+material+structure+by+temperature-controlled+water+vapor+annealing.">Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing.</a> Biomacromolecules. 12 (5), 1686-1696 (2011).</li><li>Rockwood, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin.">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).</li><li>Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vortex-induced+injectable+silk+fibroin+hydrogels.">Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels.</a> Biophysical Journal. 97 (7), 2044-2050 (2009).</li><li>Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonication-induced+gelation+of+silk+fibroin+for+cell+encapsulation.">Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation.</a> Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).</li><li>Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+repeatable+fabrication+of+high+A/R+silk+fibroin+microneedles+using+thermally-drawn+micromolds.">Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds.</a> European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).</li></ol>

استخدام الحرير/إف أن تستهدف التعبير عن البروتينات أوبتوجينتيك ويتغلب على القيود المفروضة على النهج التي قيد الاستخدام حاليا. على الرغم من أن العديد من الدراسات بنجاح استخدام حقن إف للتعبير عن البروتينات أوبتوجينيتيك، أنها تمثل تحديا لمحاذاة التعبير إلى غيض الألياف الضوئية وإلى المناطق ...

العقد الماضي أسفر انفجار هندسة البروتينات حساسة للضوء لرصد ومعالجة النشاط العصبي1. فيروسات توفر مرونة لا مثيل لها للتعبير عن هذه الأدوات أوبتوجينيتيك في المخ. وبالمقارنة بالحيوانات المحورة وراثيا، الفيروسات أسهل بكثير لإنتاج ونقل وتخزين والسماح بالتنفيذ السريع لأحدث أدوات أوبتوجينيتيك. يمكن استهداف التعبير وراثيا للسكان العصبية متميزة، والفيروسات المصممة لنقل إلى الوراء حتى يمكن أن تستخدم لاستهداف التعبير استناداً إلى اتصال الخلايا العصبية2.
عادة ما يتم إدخال الفيروسات مع حقن ستيريوتاكسيك، التي يمكن أن تكون صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. دقة استهداف المناطق الصغيرة يمكن أن تكون صعبة، بينما القيادة التعبير أكثر مجالات واسعة كثيرا ما يتطلب العديد من الحقن. وعلاوة على ذلك، عندما يكون جهاز بصري مزروع في وقت لاحق في الدماغ لتسليم الخفيفة في فيفو، عملية الزرع يجب أن تكون محاذاة بشكل صحيح مع حقن الفيروسية. هنا، يمكننا وصف أسلوب تنفيذها بسهولة عن تسليم ناقلات الأمراض الفيروسية للأنسجة حول جهاز مزروع باستخدام الحرير fibroin الأفلام3. فيبروين الحرير المتاحة تجارياً، ويتغاضى عنها جيدا بالانسجة العصبية، ويمكن استخدامها لإنتاج مواد ذات خصائص متنوعة. يمكن تطبيقها ليزرع باستخدام معدات المختبرات المشتركة مثل الماصات microinjection أفلام الحرير أو من ناحية الماصات. الأفلام الحرير/إف إلغاء شرط اثنين العمليات الجراحية والتأكد من أن الفيروس بوساطة التعبير بشكل صحيح محاذاة لزرع الضوئية. التعبير الناتج مقيد إلى غيض من الألياف، والنتائج في أقل تعبير غير المرغوب فيها على طول مسار الألياف من حقن ستيريوتاكسيك.
بالإضافة إلى إنتاج التعبير المستهدفة في غيض من ألياف صغيرة، يمكن استخدام أفلام الحرير/إف لحملة على نطاق واسع (> 3 مم) التعبير القشرية تحت windows الجمجمة. في فيفو التصوير 2-فوتون من أجهزة الاستشعار النشاط الفلورسنت أصبحت أداة لا غنى عنها لتقييم دور نشاط الخلايا العصبية في القيادة المعالجة الحسية والمعرفية. ومع ذلك، أداء التعبير على مناطق واسعة القشرية، المجربون في كثير من الأحيان لقيادة موحدة حقنات متعددة. هذه الحقن يمكن أن تستغرق وقتاً طويلاً جداً، ويمكن أن يؤدي إلى التعبير غير متناسقة عبر مجال الرؤية. وفي المقابل، الحرير/إف-المغلفة النوافذ الجمجمة سهلة للغاية صنع ويقلل كثيرا من الوقت اللازم للعمليات الجراحية، وآخر ملحوظ محرك التعبير مئات ميكرون تحت السطح القشرية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aqueous silk fibroin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5154-20ML</td>
			<td>Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector to deposit silk/AAV</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-207</td>
			<td>Nanoject III nanoliter injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator to hold implants</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>MM-33</td>
			<td>Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope to visualize silk deposits</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-6TX-FRL</td>
			<td>3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber to store implants</td>
			<td>Ablaze</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional, implant holder for storage</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>&#216;200 &#181;m Core Multimode Optical Fiber for fiber implants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrules</td>
			<td>Kientec</td>
			<td>FZI-LC-230</td>
			<td>LC Zirconia Ferrule for fiber implants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Various materials for manufacturing chronic fiber implants</td>
			<td>Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapered fiber implants</td>
			<td>Optogenix</td>
			<td>Lambda-B</td>
			<td>Tapered fiber implants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRIN lenses</td>
			<td>GoFoton</td>
			<td>CLH-100-WD002-002-SSI-GF3</td>
			<td>GRIN lenses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass cranial windows</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0726 (CS-3R-0)</td>
			<td>Small round cover glass, #0 thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large glass cranial windows</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0731 (CS-5R-0)</td>
			<td>Small round cover glass, #0 thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Various materials for manufacturing cranial windows</td>
			<td>Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo targeted expression of optogenetic proteins using silk/aav films

السعي فهم كيف العصبية دوائر المعلومات العملية من أجل إخراج محرك الأقراص السلوكية قد ساعد إلى حد كبير بوسائل بصرية وضعت مؤخرا للتلاعب ورصد نشاط الخلايا العصبية في الجسم الحي. تعتمد هذه الأنواع من التجارب على عنصرين رئيسيين هما: 1) القابلة للغرس من الأجهزة التي توفر الوصول البصرية إلى الدماغ، والبروتينات 2) حساسة للضوء أن تغيير استثارة الخلايا العصبية أو تقديم قراءات لنشاط الخلايا العصبية. وهناك عدد من الطرق للتعبير عن البروتينات حساسة للضوء، ولكن الحقن ستيريوتاكسيك من النواقل الفيروسية حاليا النهج الأكثر مرونة لأنه يمكن التحكم في التعبير بدقة الوراثية والتشريحية والزمانية. على الرغم من فائدة كبيرة من النواقل الفيروسية، إيصال الفيروس إلى الموقع الذي يزرع الضوئية يطرح العديد من التحديات. حقن فيروس ستيريوتاكسيك يطالبون بالعمليات الجراحية التي زيادة وقت الجراحة، وزيادة تكلفة الدراسات، وتشكل خطرا على صحة الحيوان. يمكن أن تتلف الأنسجة المحيطة فعلياً بحقنه الحقن ومكسبه الالتهابات الناجمة عن تسليم المفاجئ بلعه فيروسات عالية-عيار. محاذاة الحقن مع يزرع الضوئية ومن الصعوبة عند استهداف المناطق الصغيرة في أعماق الدماغ. للتغلب على هذه التحديات، يمكننا وصف طريقة لطلاء أنواع متعددة من يزرع بصري مع الأفلام تتكون من الحرير fibroin ومتجهات (إف) الفيروسية المرتبطة بالغدة. يمكن تغليف بوليمر المستمدة من الشرنقة من موري بومباي، فيبروين، وحماية الجزيئات الحيوية ويمكن معالجتها في أشكال تتراوح بين الأفلام القابلة للذوبان للسيراميك. عند زرعها في الدماغ، الطلاء الحرير/إف الإفراج عن الفيروسات في مجال التفاعل بين العناصر البصرية والدماغ المحيطة بها، ويقود التعبير تحديداً حيث أنه مطلوب. هذا الأسلوب هو تنفيذها بسهولة ويبشر بأن ييسر إلى حد كبير في فيفو دراسات مهمة الدائرة العصبية.

لتقييم نجاح الأفلام الحرير/إف في قيادة التعبير، نحن perfused الحيوانات 2-3 أسابيع بعد زرع وإعداد شرائح الدماغ من المنطقة من الفائدة. صور الأسفار من البروتينات أوبتوجينيتيك معلم فلوروفوري (ChR2-يفب) تقدم مقياسا لمدى تعبير (الشكل 1). الألياف الضوئية النموذجية (230 مي...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films at JoVE.com

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

في فيفو التعبير المستهدفة من البروتينات أوبتوجينيتيك باستخدام الأفلام الحرير/إف

وهنا نقدم طريقة لإيصال النواقل الفيروسية التعبير في الدماغ باستخدام الأفلام fibroin الحرير. هذا الأسلوب يسمح التنفيذ الهادف لناقلات التعبير باستخدام الألياف البصرية المغلفة بالحرير/إف ومدبب من الألياف الضوئية ونوافذ الجمجمة.

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب الأنظمة. مثل كيف أن نشاط الفرق العصبية يدعم المعالجة الحسية والمعرفية في الدماغ. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسهل الاستهداف الدقيق للبروتينات البصرية مثل تشان رودوpsسين وGCaMP لمناطق الدماغ ذات الاهتمام، دون الحاجة إلى إجراء حقن فيروس منفصل.إن البرهان المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية، حيث أن ترسب الحرير والفيروسات إلى غرسات بصرية صغيرة يمكن أن يستغرق بعض الممارسة من أجل تحقيق نتائج قابلة للتكرار. أولاً، ذاب المزيج AAV وخمس إلى سبع نقاط خمسة في المئة من الحرير مائي ليفي في نسبة واحد إلى واحد في أنبوب PCR 200 ميكرولتر. بلطف ماصة الحل داخل وخارج عدة مرات لخلط تماما AAV والليفي.لإيداع الحرير / AAV، تحميل ماصة حقن مع كمية من الحل المطلوبة لعدد من يزرع الألياف التي يجري إجراؤها، بالإضافة إلى ما يقرب من 30 في المئة اضافية لاستيعاب الخسائر الناجمة عن انسداد الماصات. المقبل، جبل حامل فيرول في جهاز ستيريويكسيكس مجهزة بضجين صغير. ضع حامل الزفير فوق المُقَدِر وتطبيق خليط الحرير/AAV من الأسفل.مناورة ماصة الحقن حتى يتم لمس أو لمس ما يقرب من مركز سطح الألياف البصرية، وإخراج 10 إلى 20 نانولترات من حل الحرير / AAV. ثم، سحب الماصة. بعد ذلك ، لاحظ بوليوس الحرير / AAV على السطح المسطح الذي يظهر كقبة سائلة تجف على فيلم مسطح في غضون دقيقة واحدة تقريبًا.كرر الخطوات السابقة حتى يتم إيداع المبلغ المطلوب من الحرير / AAV. عند إعداد غرسات متعددة، ضعي محلول الحرير/AAV على غرسة واحدة ثم انتقل إلى معطف الغرسات الأخرى، قبل العودة إلى الأولى. بعد ساعة واحدة من التجفيف، ضع حامل النهمة بأكمله في غرفة فراغ وفراغ جفاف بين عشية وضحاها في حوالي 125 تور وأربع درجات مئوية.في اليوم التالي، قم بتقييم شكل ومكانة فيلم الحرير الناتج تحت مجهر عالي الطاقة. تأكد من أن الأفلام محصورة في طرف سطح الألياف البصرية، رقيقة نسبيا، ومتناظرة. للطلاء مدبب الألياف البصرية، ضع ماصة حقن الحرير/AAV ضد جانب الألياف البصرية في بداية التفتق، والتأكد من أن الماصات لمس الألياف البصرية.Eject 20 نانويت من الحرير / AAV لبدء عملية الطلاء، وضمان أن القطرة تلتزم الألياف البصرية وتبقى في واجهة الألياف والماصات. بلطف الفتيل قطرات نحو نهاية تلميح الألياف كما يجف الحرير / AAV، والحفاظ على ماصة الحقن في اتصال مع قطرات التجفيف لتجنب انسداد تلميح ماصة. عندما قد جفت البلوس الأول تماما تقريبا، وطرد آخر 20 نانويلتر ومواصلة فتل قطرة على طول تفتق.كرر الخطوة السابقة عن طريق إخراج كميات صغيرة من الحرير / AAV ، وتجفيف الحل تدريجيا حتى جانب التفتق. بعد التجفيف، تقييم شكل وموقف من فيلم الحرير الناتجة تحت مجهر عالية الطاقة. لطلاء عدسة GRIN يزرع، إيداع الحرير / AAV في حقنة واحدة على زرع عدسة GRIN.بعد التجفيف، قم بتقييم شكل وضعية فيلم الحرير الناتج تحت مجهر عالي الطاقة لضمان أن يغطي الفيلم سطح العدسة. لطلاء الزجاج القحفية النوافذ، اليد ماصة قطرة خمسة ميكرولتر من الحرير / AAV على سطح زلة غلاف جولة ثلاثة ملليمتر بحيث تنتشر قطرات خارج لتغطية سطح الزجاج بأكمله. بعد التجفيف، قم بتخزين الألياف البصرية المغلفة بالحرير/AAV في جهاز تجفيف فراغي مبرد عند 125 تور وأربع درجات مئوية قبل زرع الأجهزة.قدمت صور الفلوريسنس للبروتينات البصرية الموسومة بالفلوروهور مقياسًا لمدى التعبير عن أفلام الحرير / AAV ، ويمكن للألياف البصرية النموذجية استيعاب 200 نانويلتر من الحرير / AAV بسهولة. مع الممارسة، يمكن للمجربين تحقيق تعبير موثوق به للغاية حول غيض من الألياف المزروعة. هناك مسألتان محتملتان مع النوافذ القحفية المغلفة هما التعبير غير الكافي، وأفلام الحرير التي تفشل في الذوبان، وتحجب مجال الرؤية.لزيادة التعبير، يمكن إجراء استئصال الزجري قبل زرع النافذة، و/ أو زيادة كمية الفيروس في الفيلم. تم تحقيق أفضل تعبير باستخدام خليط واحد إلى أربعة من الحرير والأوراق المالية AAV، على التوالي. كمية الحرير في النوافذ المطلية هي 10 إلى 100 مرة أكثر من يزرع الألياف، والفيلم هو أقل جزءا لا يتجزأ في الأنسجة، وبالتالي قد لا تتعرض لنفس مستويات النشاط البروتيوليك التي يمكن أن تذوب أفلام الحرير.ومع ذلك ، فإن وجود بعض الحرير ضروري لتحقيق التعبير الخاص بك تحت النوافذ ، على الأرجح لأن الفيلم المصنوع من الفيروس وحده يتم غسله من قبل السائل الخلالي أثناء الجراحة. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم إعداد وتخزين الغرسات المغلفة بالحرير بالطريقة التي نصفها. قد يؤدي التخزين غير السليم إلى تغيير خصائص أفلام الحرير، أو تقليل فعالية متجهات التعبير الفيروسي.يمكن أن تكون هذه التقنية ذات فائدة كبيرة للباحثين في مجال علم الأعصاب في مجال الأنظمة لاستكشاف كيفية دفع النشاط العصبي للمعالجة الحسية والمعرفية في أدمغة الثدييات مثل الفئران أو الفئران أو حتى الرئيسيات غير البشرية. لا تنس أن العمل مع ناقلات التعبير الفيروسية يمكن أن تكون خطرة ومعدات الحماية الشخصية، مثل القفازات، نظارات واقية، ومعاطف المختبر، ينبغي أن ترتديه دائما أثناء العمل مع الفيروس المرتبطة أدينو.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

الفيروسية تنبيغ الانتقائي للبالغين المولودين في الخلايا العصبية الشمية لالمزمنة في الجسم الحي تحفيز Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

الفلورسنت وصفها الوراء يسمح لخارج الخلية المستهدفة واحدة وحدة التسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها<em&gt; في الجسم الحي</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Optogenetic تنشيط الخلايا العصبية الحسية الجسدية اسماك الزرد باستخدام الشيف-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic تحفيز السلوك في الهروب<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

وهناك طريقة للتحكم عالي الدقة Optogenetic من الخلايا العصبية الفردية الهرمية<em&gt; في الجسم الحي</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

متزامنة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نظام مخطط كهربية

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

فيفو السابقين علم البصريات الوراثي تشريح الدوائر الخوف في الدماغ شرائح

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

تحديد التعبير عن سطح الخلية ومعدل إندوسيتيك من البروتينات في الثقافات أستروسيت الابتدائية باستخدام بيوتينيلاتيون

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...