Name: in vivo targeted expression of optogenetic proteins using silk/aav films
Uploaded: 2019-02-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films at JoVE.com

המחברים רוצים להודות ג'יי וזקאוז לאיורים, קפלן ד ו ג Preda עבור ריאגנטים הדרכה מועילה, ואת המעבדות של ב' סבאטיני והארווי ג עבור הדמיה ויוו . מיקרוסקופ התאפשרה על ידי מ Ocana ומרכז נוירוביולוגיה הדמיה, נתמך בחלקה על ידי המרכז לדימות העצבי כחלק של לאומי המכון של הפרעות נוירולוגיות ולהעניק מרכז הליבה P30 שבץ (NINDS) (NS072030). עבודה זו נתמכה על ידי קרן נבון Khodadad המשפחה, קרן ננסי לוריא סימני, ו על ידי מענקים NIH, NINDS R21NS093498, U01NS108177 ו- NINDS R35NS097284 כדי W.G.R, ועל ידי של NIH בתר F32NS101889 כדי C.H.C.

כל הניסויים המערבות בעלי חיים בוצעו על פי פרוטוקולים אושרה על ידי הוועדה המתמדת הרווארד על החיה אכפת בהנחיות הבאות תיאר ב NIH לנו מדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה. עכברים בוגרים C57BL/6 של מין או (מגיל 6-15 שבועות) שימשו עבור כל הניסויים.
1. לקבל מימית Fibroin משי
<ol><li>להכין א?...

<ol>
	<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Tervo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Designer+AAV+Variant+Permits+Efficient+Retrograde+Access+to+Projection+Neurons.">A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+Fibroin+Films+Facilitate+Single-Step+Targeted+Expression+of+Optogenetic+Proteins.">Silk Fibroin Films Facilitate Single-Step Targeted Expression of Optogenetic Proteins.</a> Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).</li><li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue.">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), e50004 (2012).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors.">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time.">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits.">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).</li><li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cortical,+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses.">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+sectioning+of+slice+preparations+for+immunohistochemistry.">Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), 194 (2007).</li><li>Cao, Y., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+silk+biomaterials.">Biodegradation of silk biomaterials.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (4), 1514-1524 (2009).</li><li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission.">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li><li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nature Neuroscience. 13 (5), 584-591 (2010).</li><li>Hines, D. J., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+controlled+release+from+silk+fibroin+films.">Mechanisms of controlled release from silk fibroin films.</a> Biomacromolecules. 12 (3), 804-812 (2011).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+silk+material+structure+by+temperature-controlled+water+vapor+annealing.">Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing.</a> Biomacromolecules. 12 (5), 1686-1696 (2011).</li><li>Rockwood, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin.">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).</li><li>Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vortex-induced+injectable+silk+fibroin+hydrogels.">Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels.</a> Biophysical Journal. 97 (7), 2044-2050 (2009).</li><li>Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonication-induced+gelation+of+silk+fibroin+for+cell+encapsulation.">Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation.</a> Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).</li><li>Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+repeatable+fabrication+of+high+A/R+silk+fibroin+microneedles+using+thermally-drawn+micromolds.">Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds.</a> European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).</li></ol>

השימוש של משי/AAV למקד את הביטוי של חלבונים optogentic גוברת על המגבלות של גישות הנמצאים כיום בשימוש. למרות מחקרים רבים להשתמש בהצלחה AAV זריקות כדי להביע optogenetic חלבונים, זה מאתגר כדי ליישר את הביטוי עד הקצה של סיבים אופטיים באזורים סביב אורך סיבים ישרים, לאזור הצפייה של עדשה חיוך. בגלל חוסר התאמה ב...

בעשור האחרון יצר פיצוץ של חלבונים רגישים לאור מהונדסים עבור ניטור וטיפול פעילות עצבית1. וירוסים מציעים לו גמישות מרבית לביטוי כלים אלה optogenetic במוח. בהשוואה לבעלי חיים מהונדס, וירוסים הם הרבה יותר קל לייצר להעביר, לאחסן, המאפשר יישום מהיר של הכלים optogenetic החדש. ניתן לפלח ביטוי גנטי לאוכלוסיות עצביים שונים, וירוסים תוכנן עבור העברת רטרוגרדית ואפילו יכולה לשמש למטרה הביטוי מבוסס על קישוריות עצביים2.
הנגיפים מוחדרים בדרך כלל עם זריקות stereotaxic, אשר יכול להיות זמן רב ומאתגר. בדיוק פילוח אזורי קטן יכול להיות קשה, בזמן נהיגה ביטוי מעל אזורים רחבים לעיתים קרובות דורש זריקות רבות. יתר על כן, כאשר מכשיר אופטי לאחר מכן מושתל לתוך המוח כדי לספק אור ויוו, השתל חייב כראוי ליישר עם הזריקה ויראלי. כאן, אנו מתארים שיטה ליישם בקלות להעברת נגיפי וקטורים לרקמות מסביב התקן מושתל באמצעות סרטי משי fibroin3. Fibroin משי זמינים מסחרית, נסבל היטב על ידי רקמות עצביות, והוא יכול לשמש כדי לייצר חומרים עם מאפיינים מגוונים. סרטי משי שניתן להחיל על שתלים בעזרת ציוד מעבדה נפוץ כמו פיפטות microinjection או יד מדי סוכר. סרטי משי/AAV לחסל את הדרישה שני ניתוחים ולהבטיח כי הביטוי וירוס בתיווך מיושר כראוי השתל אופטי. הביטוי שנוצר מוגבלת עד הקצה של סיבים, ותוצאות פחות ביטוי לא רצויות לאורך המסלול סיבים מאשר זריקות stereotaxic.
בנוסף לייצור ביטוי יישוב בקצה של סיבים קטנים, סרטי משי/AAV יכול לשמש כדי לנהוג נרחבת (> בקוטר 3 מ מ) ביטוי קורטיקלית מתחת windows הגולגולת. In vivo פוטון 2 הדמיה של פעילות פלורסנט חיישנים הפך להיות כלי חיוני להעריך את התפקיד של פעילות. עצבית נהיגה עיבוד חושי קוגניטיבית. אולם, לנהוג אחיד הביטוי על פני שטחים נרחבים קורטיקלית, ניסויים לעיתים קרובות לבצע זריקות מרובות. זריקות אלה פקוקה מאוד והוא יכול להוביל ביטוי לא עקביים על-פני שדה הראייה. לעומת זאת, משי/AAV-מצופה חלונות הגולגולת הם מאוד קל לייצר, להפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש עבור ניתוחים, ולנסוע ביותר להפליא ביטוי מאות מיקרונים מתחת לפני השטח קורטיקלית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aqueous silk fibroin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5154-20ML</td>
			<td>Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector to deposit silk/AAV</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-207</td>
			<td>Nanoject III nanoliter injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator to hold implants</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>MM-33</td>
			<td>Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope to visualize silk deposits</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-6TX-FRL</td>
			<td>3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber to store implants</td>
			<td>Ablaze</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional, implant holder for storage</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>&#216;200 &#181;m Core Multimode Optical Fiber for fiber implants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrules</td>
			<td>Kientec</td>
			<td>FZI-LC-230</td>
			<td>LC Zirconia Ferrule for fiber implants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Various materials for manufacturing chronic fiber implants</td>
			<td>Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapered fiber implants</td>
			<td>Optogenix</td>
			<td>Lambda-B</td>
			<td>Tapered fiber implants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRIN lenses</td>
			<td>GoFoton</td>
			<td>CLH-100-WD002-002-SSI-GF3</td>
			<td>GRIN lenses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass cranial windows</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0726 (CS-3R-0)</td>
			<td>Small round cover glass, #0 thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large glass cranial windows</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0731 (CS-5R-0)</td>
			<td>Small round cover glass, #0 thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Various materials for manufacturing cranial windows</td>
			<td>Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo targeted expression of optogenetic proteins using silk/aav films

המסע להבין את המעגלים העצביים כמה פרטי התהליך על מנת כונן התנהגות פלט בגילויים במידה רבה על ידי שיטות אופטי שפותחה לאחרונה עבור טיפול ומעקב אחר הפעילות של הנוירונים vivo בתוך. סוגים אלה של ניסויים מסתמכים על שני מרכיבים מרכזיים: 1) מושתלת מכשירים המספקים גישה אופטי אל המוח, וחלבונים 2) רגישים לאור משנה דעתנית עצביים או לספק readout פעילות. עצבית. ישנן מספר דרכים לבטא חלבונים רגישים לאור, אך הזרקת stereotaxic של וקטורים ויראלי היא כיום הגישה הגמישה ביותר כי הביטוי יכול להיות נשלט עם דיוק גנטי אנטומי, זמני. למרות השירות נהדר של וקטורים ויראלי, העברת הוירוס לאתר של שתלים אופטי מציבה אתגרים רבים. וירוס stereotaxic זריקות דורשים ניתוחים להגדיל את זמן הניתוח, להגדיל את העלות של מחקרים, ולא להוות סיכון לבריאות של החיה. הרקמה שמסביב, אליו יכול להיפגע פיזית על ידי המזרק הזרקה, ועל ידי immunogenic דלקת הנגרמת על ידי מסירה פתאומי של סיילין וירוס כייל גבוה. יישור זריקות עם שתלים אופטי הוא קשה במיוחד כאשר המיקוד אזורים קטנים עמוקים במוח. כדי להתגבר על האתגרים הללו, אנו מתארים שיטה ציפוי מספר סוגים של שתלים אופטי עם סרטים מורכב fibroin משי ווקטורים Adeno-הקשורים ויראלי (AAV). Fibroin, פולימר נגזר מן הגולם של טוואי המשי, ניתן לכמס להגן על מולקולות ואני יכול להיות מעובד לצורות ועד סרטים מסיסים קרמיקה. מושתל לתוך המוח, משי/AAV ציפויים שחרר וירוס על הממשק בין רכיבים אופטיים המוח שמסביב, נהיגה ביטוי בדיוק איפה הוא נחוץ. שיטה זו מתבצעת בקלות, ומבטיח להקל במידה רבה על ויוו מחקרים של מעגל עצבי פונקציה.

כדי להעריך את ההצלחה של סרטי משי/AAV נהיגה ביטוי, אנו perfused חיות 2-3 שבועות לאחר ההשתלה, המוכן פרוסות המוח מאזור עניין. קרינה פלואורסצנטית תמונות של חלבונים מתויג fluorophore optogenetic (ChR2-YFP) סיפק אמצעי מדידה של מידת הביטוי (איור 1D). סיבים אופטיים טיפוסי (קוטר מיקרומטר 23...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films at JoVE.com

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

אין ויוו יישוב ביטוי של חלבונים Optogenetic באמצעות סרטי משי/AAV

כאן, אנו מציגים שיטה להעברת נגיפי ביטוי וקטורים למוח באמצעות סרטי משי fibroin. שיטה זו מאפשרת משלוח ממוקד של וקטורים ביטוי באמצעות סיבים אופטיים מצופים משי/AAV, סיבים אופטיים מחודדות וחלונות הגולגולת.

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח של מערכות. כגון כיצד הפעילות של הרכבים עצביים תומכת בעיבוד חושי וקוגניטיבי במוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מקלה על מיקוד מדויק של חלבונים אופטוגנטיים כמו צ'אן רודופסין ו- GCaMP לאזורי עניין במוח, ללא צורך בהליך הזרקת וירוס נפרד.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כמו התצהיר של משי ווירוס שתלים אופטיים קטנים יכול לקחת קצת תרגול על מנת להשיג תוצאות לשחזור. ראשית, מערבבים AAV מופשר וחמש עד שבע נקודות חמישה אחוזים פיברוין משי מים ביחס של אחד לאחד בצינור PCR 200 מיקרוליטר. בעדינות pipette הפתרון פנימה ובחוץ מספר פעמים כדי לערבב ביסודיות את AAV ו fibroin.כדי להפקיד את המשי / AAV, לטעון פיפטה הזרקה עם כמות הפתרון הנדרש עבור מספר שתלים סיבים שנעשו, בתוספת כ 30 אחוזים נוספים כדי להכיל הפסדים עקב סתימת פיפטה. לאחר מכן, הר מחזיק ferrule לתוך מנגנון סטריאוטוקסי מצויד microinjector. מניחים את מחזיק ferrule מעל microinjector ולהחיל את תערובת משי / AAV מלמטה.לתמרן את פיפטה ההזרקה עד שהוא נוגע או כמעט נוגע במרכז פני השטח סיב אופטי, ולפלט 10 עד 20 nanoliters של פתרון משי / AAV. לאחר מכן, למשוך את פיפטה. לאחר מכן, להתבונן בולוס של משי / AAV על פני השטח השטוחים אשר מופיע כמו כיפה נוזלית כי מתייבש לסרט שטוח בתוך כדקה אחת.חזרו על השלבים הקודמים עד להפקדת הכמות הרצויה של משי/AAV. בעת הכנת שתלים מרובים, להחיל את פתרון משי / AAV על שתל אחד ולאחר מכן לעבור מעיל שתלים אחרים, לפני החזרה הראשון. לאחר שעה אחת של ייבוש, מניחים את כל מחזיק ferrule לתוך תא ואקום ואקום להתייבש לילה בערך 125 טור וארבע מעלות צלזיוס.ביום שלמחר, להעריך את הצורה והמיקום של סרט המשי וכתוצאה מכך תחת מיקרוסקופ בה עוצמה גבוהה. ודא שהסרטים מוגבלים לקצה משטח הסיב האופטי, דק יחסית וסימטרי. לציפוי סיבים אופטיים מחודדים, מקם את פיפט הזרקת המשי/AAV בצד הסיב האופטי בתחילת ההתחדדות, וודא שהפיגט נוגע בסיבים האופטיים.להוציא 20 nanoliters של משי / AAV כדי להתחיל את תהליך הציפוי, להבטיח כי טיפה דבק סיבים אופטיים ונשאר בממשק של סיבים פיפטה. בעדינות פתיל את הטיפה לקראת סוף קצה הסיבים כמו משי / AAV מתייבש, ולשמור על פיפטה הזרקה במגע עם טיפת ייבוש, כדי למנוע סתימת קצה פיפטה. כאשר הבולוס הראשון התייבש כמעט לחלוטין, להוציא עוד 20 nanoliters ולהמשיך פתיל את טיפה לאורך ההתחדדות.חזור על השלב הקודם על ידי הוצאת כמויות קטנות של משי / AAV, ובהדרגה ייבוש הפתרון במעלה הצד של ההתחדדות. לאחר הייבוש, להעריך את הצורה והמיקום של סרט משי וכתוצאה מכך תחת מיקרוסקופ בה עוצמה גבוהה. לציפוי שתלי עדשת GRIN, יש להפקיד משי/AAV בזריקה אחת על שתל עדשת GRIN.לאחר הייבוש, להעריך את הצורה והמיקום של סרט המשי וכתוצאה מכך תחת מיקרוסקופ כוח גבוה כדי להבטיח כי הסרט מכסה את פני השטח של העדשה. עבור ציפוי חלונות גולגולתיים מזכוכית, יד פיפטה טיפה חמישה מיקרוליטר של משי / AAV על פני השטח של כיסוי עגול שלושה מילימטר להחליק, כך טיפה מתפשטת כדי לכסות את משטח הזכוכית כולו. לאחר הייבוש, יש לאחסן את הסיבים האופטיים מצופים המשי/AAV במייבש ואקום מקורר ב-125 מעלות וארבע מעלות לפני השתלת המכשירים.תמונות פלואורסצנטיות של חלבונים אופטוגנטיים המתויגים על ידי פלואורופור סיפקו מדד להיקף הביטוי של סרטי המשי/AAV, וסיבים אופטיים טיפוסיים יכולים להכיל בקלות 200 ננוליטר של משי/AAV. עם תרגול, ניסויים יכולים להשיג ביטוי אמין מאוד סביב קצה סיבים מושתלים. שתי בעיות אפשריות עם חלונות גולגולתיים מצופים אינן מספיקות, וסרטי משי שאינם מתמוססים ומטשטשים את שדה המבט.כדי להגביר את הביטוי, ניתן לבצע כריתת דורה לפני השתלת החלון, ו/או הגדלת כמות הנגיף בסרט. הביטוי הטוב ביותר הושג באמצעות תערובת אחת עד ארבע של משי ו- AAV טיטר מניות, בהתאמה. כמות המשי בחלונות מצופים גדולה פי 10 עד 100 מאשר על שתלי סיבים, והסרט מוטמע פחות ברקמה, ולכן ייתכן שלא ייחשף לאותן רמות של פעילות פרוטאו-אוליטית שיכולה להמיס סרטי משי.עם זאת, נוכחות של משי כלשהו חיוני להשגת הביטוי שלך מתחת לחלונות, ככל הנראה בגלל סרט עשוי וירוס לבד נשטף על ידי נוזל interstitial במהלך הניתוח. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להכין ולאחסן שתלים מצופים משי באופן שאנו מתארים. אחסון לא תקין עשוי לשנות את המאפיינים של סרטי משי, או להקטין את היעילות של וקטורים ביטוי ויראלי.טכניקה זו יכולה להיות תועלת רבה עבור חוקרים בתחום מדעי המוח של מערכות כדי לחקור כיצד פעילות עצבית מניעה עיבוד חושי וקוגניטיבי במוחם של יונקים כגון עכברים, חולדות, או אפילו פרימטים לא אנושיים. אל תשכח כי עבודה עם וקטורים ביטוי ויראלי יכול להיות מסוכן וציוד מגן אישי, כגון כפפות, משקפי מגן, חלוקי מעבדה, תמיד צריך להיות משוחק תוך כדי עבודה עם וירוס הקשורים אדנו.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

הפעלה של נוירונים Optogenetic דג זברה החושית באמצעות שף tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

גירוי Optogenetic של התנהגות בריחה ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...